METTL16通过调节pri-miR-511的m6A修饰来抑制自噬，从而改善吸烟引起的慢性阻塞性肺疾病（COPD）中的肺气肿

《International Immunopharmacology》：METTL16 improves cigarette smoking-induced COPD emphysema through inhibiting autophagy by mediating pri-miR-511 m6A modification

COPD肺气肿中METTL16通过m6A修饰pri-miR-511调控miR-511-3p/NR4A1轴影响自噬。

　　

蔡晓宇|黄斌|高峰|胡杰|杨芳|唐彦平|于金|谭晓明|王长明|秦慧萍

桂林医学院，中国桂林541199

摘要

香烟烟雾通过多种机制成为慢性阻塞性肺疾病（COPD）和肺气肿的重要诱因。METTL16是一种重要的甲基转移酶，可介导mRNA、lncRNA和snRNA中的N6-甲基腺苷（m6A）修饰，而其在CS-COPD（吸烟相关COPD）中对于pri-miRNA（前体miRNA）的m6A修饰的作用尚未被研究。RT-qPCR和免疫化学技术显示，COPD患者的肺样本中METTL16的表达显著下调。研究人员构建了一种肺泡上皮特异性METTL16敲除小鼠模型，该模型表现出更严重的CS-COPD病理变化。METTL16过表达可以阻止香烟烟雾提取物（CSE）诱导的自噬过程，而METTL16沉默则会产生相反的效果。在本研究中，我们通过甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）和mRNA微阵列分析发现，COPD患者的肺组织中m6A修饰的pri-miR-511水平降低，核受体4A1（NR4A1）的转录本水平升高。机制上，METTL16上调通过m6A修饰增强了miR-511–3p的表达，从而抑制了CSE诱导的自噬。生物信息学分析和双荧光素酶报告基因检测系统证实了miR-511–3p与NR4A1之间的相互作用。miR-511–3p模拟物的转染降低了NR4A1的表达，进而减少了体外自噬。因此，我们认为METTL16可能通过miR-511–3p/NR4A1轴在m6A依赖的方式中缓解自噬，从而对CS诱导的COPD肺气肿具有保护作用。

引言

香烟烟雾含有7000多种化学物质，这些燃烧产物会导致环境污染并危害人体健康[1]。中国是世界上烟草消费量最大的国家，每年有数千人因暴露于香烟烟雾而死亡[2]。慢性阻塞性肺疾病（COPD）是由于反复发作的慢性支气管炎导致的，会引起小气道重塑和肺泡结构异常，表现为呼吸困难、咳嗽和咳痰等症状[3]。肺气肿是COPD的重要病理特征，会损害肺功能并引发呼吸系统症状[4],[5]。吸烟是COPD的主要风险因素[6]。香烟烟雾通过引发氧化应激、蛋白酶/抗蛋白酶系统失衡、炎症和程序性细胞死亡来破坏肺上皮细胞，从而促进肺气肿的发生[7],[8]。自噬作为一种细胞保护机制，通过溶酶体依赖途径选择性地降解受损的细胞器和错误折叠的蛋白质。异常的自噬与呼吸系统疾病密切相关[9]。多项研究表明，香烟烟雾暴露引起的肺上皮细胞自噬失调[10],[11]与COPD肺气肿的病理生理过程有关。然而，香烟烟雾在COPD肺气肿中调节自噬的具体机制仍不明确。

N6-甲基腺苷（m6A）修饰是真核RNA（包括信使RNA和非编码RNA）中常见的表观遗传修饰[12],[13]。这是一种动态且可逆的过程，对基因表达、代谢和功能有深远影响，受“写入者”、“擦除者”和“读取者”的动态调控[14]。已有研究证实m6A修饰与COPD的进展有关[15]。先前的研究表明，上调的甲基转移酶样蛋白3（METTL3）这种著名的m6A甲基化酶可促进M1巨噬细胞和BEAS-2B细胞的焦亡[16],[17]。最近，作为甲基转移酶家族成员的METTL16因其在疾病进展中的关键作用而受到越来越多的关注[18]。最新证据表明，PM2.5处理的肺微血管中METTL16水平升高会促进细胞损伤，进而导致COPD[19]。另一项研究显示，CS-COPD中METTL16表达下调，可防止COPD的进展[20]。METTL16在COPD中的功能仍存在争议。此外，METTL16上调可通过自噬途径抑制膀胱癌细胞的增殖并增强化疗敏感性[21]。据我们所知，关于METTL16是否以及如何调节COPD肺气肿中的自噬，目前的研究还很少。

微小RNA（miRNA）是一类非编码小RNA，作为基因表达的关键转录后调控分子，与COPD的发病机制密切相关[22]。miRNA的生物合成始于初级miRNA转录本（pri-miRNA）的切割，生成前体miRNA（pre-miRNA），随后产生成熟的miRNA[23]。新兴证据表明，miRNA的加工与m6A修饰之间存在广泛的相互作用[23]，这与多种疾病相关[24]。已有研究报道METTL3和METTL14以m6A依赖的方式促进pri-miRNA的加工，这会促进肺癌和心脏病的发展[25],[26]。最近的研究发现METTL16对RNA（包括pri-miRNA）的m6A修饰具有响应性[27]。通过对COPD和非COPD患者的肺组织进行m6A微阵列分析，发现COPD组中m6A修饰的pri-miR-511水平较低。先前的研究表明，miR-511–3p（由pri-miR-511成熟而来）在肺部炎症中具有保护作用[28]。然而，METTL16是否介导pri-miR-511的m6A修饰以及对COPD肺气肿的进一步影响仍不清楚。

在本研究中，我们发现COPD肺气肿患者和小鼠的肺样本中METTL16表达下调。在CS-COPD小鼠和细胞模型中上调或敲低METTL16可以减轻或加剧由香烟烟雾引起的自噬。MeRIP和RT-qPCR结果表明METTL16参与了pri-miR-511的m6A修饰以及miR-511–3p表达的调节。通过mRNA微阵列分析和数据库预测，我们发现核受体亚家族4A组1成员1（Nur77或NR4A1）在COPD中的表达升高，它是miR-511–3p的下游靶分子。NR4A1过表达会削弱METTL16的保护作用。我们的发现表明，METTL16/m6A/miR-511–3p/NR4A1轴可能通过调节自噬在CS诱导的COPD肺气肿发展中起关键作用。

人类肺标本来源和人口统计数据

在切除良性肺病变后，从桂林医学院附属的桂林人民医院收集了COPD和非COPD患者的肺组织样本。分离后，肺组织样本被冷冻在液氮中或用福尔马林固定。COPD的诊断遵循慢性阻塞性肺疾病（GOLD）指南。我们研究中使用的人类标本已获得桂林人民医院伦理委员会的充分许可。

COPD患者、CS-COPD小鼠和细胞模型中METTL16表达下调

为了探讨甲基转移酶在COPD中的作用，我们收集了COPD和非COPD患者的肺组织样本，并使用RT-qPCR检测了METTL3、METTL14和METTL16的表达。与非COPD患者相比，COPD患者的肺组织中METTL3和METTL14的表达升高，而METTL16的表达降低（图1A-C）。为了验证METTL16的下调，我们评估了其他COPD患者和CS-COPD小鼠中的METTL16水平。

讨论

COPD是一种临床综合征，其特征是支气管病变和/或肺泡结构异常，这是环境与基因相互作用的结果，具有明显的异质性[34]。香烟烟雾会导致肺上皮细胞的表观遗传改变，如DNA甲基化、组蛋白乙酰化、m6A修饰异常和非编码RNA失衡，这些变化已被证实与COPD的发病机制有关[22],[35]。m6A作为表观遗传学领域的新星，其作用日益受到关注...

结论

简而言之，我们的数据显示，COPD患者和动物模型中的METTL16表达下调，导致m6A修饰的pri-miR-511转录本减少，同时miR-511–3p表达也降低，进而影响与CS-COPD肺气肿相关的自噬。miR-511–3p的异位表达会抑制CSE诱导的NR4A1介导的自噬。这些结果表明，METTL16/m6A/miR-511–3p/NR4A1轴可能是COPD肺气肿的新治疗靶点。

数据和材料的可用性

数据可应要求提供。

作者贡献声明

蔡晓宇：撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、数据分析。黄斌：撰写——审稿与编辑、验证、项目管理、实验设计。高峰：资源提供、实验设计、数据分析。胡杰：资源提供、实验设计、数据分析。杨芳：验证、实验设计。唐彦平：方法学、实验设计。于金：资源提供、实验设计。谭晓明：软件使用、方法学。王长明：撰写——审稿与编辑、监督

资助

本研究得到了国家自然科学基金（编号：82160014、82160002）和广西自然科学基金（编号：2021GXNSFBA220071）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。