《International Immunopharmacology》：Milk exosomes loaded with atorvastatin suppress fibroblast activation and extracellular matrix remodeling via the TGF-β/SMAD pathway in ligamentum flavum hypertrophy
编辑推荐：
黄韧带肥厚（LFH）是脊柱狭窄症的主要病理机制，本研究构建阿托伐他汀（Ato）负载乳源外泌体（mExo）递送系统，通过抑制TGF-β1-SMAD2/3信号通路显著改善LFH。实验显示Ato@mExo在体内外均优于单一组分，证实外泌体递送系统在纤维化治疗中的潜力。
李健|李天阳|魏金鹏|赵宏琦|徐涛|陈光志|方轩|柯文涛|盛高红|吴华|郝海湖
中国山西省太原市，山西医科大学第三医院、山西白求恩医院、山西省医学科学院、同济山西医院骨科
摘要
引言
黄韧带肥大（LFH）是脊柱狭窄的主要病理生理机制。乳汁外泌体（mExo）作为一种有前景的药物递送候选物逐渐受到关注。在本研究中，我们构建了一种有效的阿托伐他汀（Ato）递送系统，并探讨了其在LFH治疗中的潜在作用。
方法
本研究首先利用生物信息学分析方法及人类黄韧带（LF）组织，研究了LFH中的分子生物学变化。随后提取mExo，并制备了载有阿托伐他汀的乳汁外泌体（Ato@mExo）。最后通过体内和体外实验，研究了Ato、mExo及Ato@mExo对LFH发病机制的影响。
结果
研究发现LFH样本中纤维连接蛋白、III型胶原、I型胶原和TGF-β1的水平显著升高，同时胶原纤维与弹性纤维的比例失衡。透射电子显微镜（TEM）和纳米粒子追踪分析（NTA）的结果证实了mExo和Ato@mExo的有效制备。进一步实验表明，Ato、mExo及Ato@mExo能够有效抑制TGF-β1诱导的纤维化相关蛋白（如纤维连接蛋白、III型胶原、I型胶原和α-SMA）在人类LF细胞中的表达。机制研究表明，Ato、mExo及Ato@mExo通过阻断TGF-β1-SMAD2/3信号通路抑制LF细胞中的纤维化。此外，Ato、mExo及Ato@mExo还能改善体内机械应力引起的LFH。体内和体外实验均显示Ato@mExo具有更强的抑制效果。
结论
本研究表明，Ato、mExo及Ato@mExo通过抑制TGF-β1-SMAD2/3信号通路缓解LFH。其中，Ato@mExo的抑制效果更为显著。这些发现提示Ato@mExo有望成为LFH早期预防和治疗的候选药物。
引言
退行性腰椎管狭窄（LSS）是老年人腰痛和步态异常的最常见原因，也是65岁以上患者进行腰椎手术的主要指征，严重影响其生活质量[1]。全球约有1.03亿人受LSS影响，给个人和社会带来沉重经济负担[2]。根据现有临床治疗指南，症状的改善主要依赖于手术治疗。然而，早期预防和非手术治疗的有效性仍需进一步证实[3][4]。LSS的病理生理机制涉及多种因素，包括机械损伤、生化和遗传因素。其中，黄韧带（LF）肥大（LFH）被认为是腰椎管狭窄的重要原因之一[5]。LF是脊柱后柱的重要组成部分，覆盖并保护硬膜囊的后部。在健康个体中，LF约80%由弹性纤维组成，20%由胶原纤维组成，主要含有成纤维细胞[6]。在反复机械应力、衰老和肥胖等条件下，LF中的弹性纤维减少而胶原纤维增多，导致LFH，进而压迫脊髓和神经根，引发腰痛、间歇性跛行和下肢肌肉无力等症状[7]。多项研究表明，多种细胞因子与LFH密切相关，如转化生长因子β1（TGF-β1）、基质金属蛋白酶及其抑制剂、结缔组织生长因子、基本成纤维细胞生长因子等炎症相关细胞因子可能参与纤维化过程[8]。TGF-β1是一种促纤维化的炎症细胞因子，与多种器官和组织的纤维化有关。TGF-β1与其II型受体结合，激活具有激酶结构的I型受体并磷酸化SMAD2/3，后者与SMAD4结合形成异三聚体复合物，通过直接结合启动子调节多种基因的表达，包括结缔组织生长因子（CTGF）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和胶原。在LFH中，TGF-β1水平的显著升高是纤维化的重要病理机制[9]。通过调节这些细胞因子的表达来抑制LFH成为治疗LSS的潜在策略。
阿托伐他汀（Ato）是一种强效的内源性胆固醇合成抑制剂，广泛用于治疗血脂异常的一线治疗，具有显著的降脂和稳定斑块作用，显著降低动脉粥样硬化性心血管疾病的风险[10]。然而，Ato的药理作用不仅限于此领域。研究表明，Ato可通过抗氧化、抗炎和抗凋亡等多种途径调节病理变化，减轻组织纤维化[11]。Orkaby等人发现他汀类药物可延缓动脉粥样硬化的进展，促进动脉粥样硬化逆转并改善心血管结局[12]。Zhang等人的小鼠体内实验表明，Ato通过上调肾内皮型一氧化氮合酶（eNOS）表达，减轻糖尿病小鼠的肾纤维化损伤，降低氧化应激和炎症，改善铁死亡信号通路，并减少线粒体损伤[13]。Thit M. Kronborg等人进行的双盲随机安慰剂对照临床试验显示，Ato对肝硬化患者具有抗炎和潜在的抗纤维化作用[14]。现有证据表明，Ato是治疗纤维化疾病的有效药物。然而，Ato在LFH中的作用尚待明确。进一步研究Ato在LFH中的药理机制可能带来新的治疗手段。
近年来，细胞外载体（EVs），尤其是外泌体（Exo）作为细胞间通讯和信号传导的重要介质受到关注[15]。EVs的大小介于30至100纳米之间，来源于内体系统，含有蛋白质、脂质、mRNA、miRNA和lncRNA等多种生物分子，参与免疫反应、组织修复和炎症等生物过程，在病理学中发挥重要作用[16]。越来越多的研究强调它们作为新型生物标志物和治疗靶点的潜力。EVs能够将mRNA、microRNA（miRNAs）、蛋白质和脂质等生物分子从供体细胞转移到受体细胞，使其成为天然的药物递送载体[17]。与合成药物载体相比，Exo因其靶向组织递送、长半衰期、高生物相容性和低毒性等独特特性而成为理想的药物递送平台[17]。其中，来自牛奶的乳汁外泌体（mExo）被证明是口服给药的有前景的外泌体候选物，具有高生物相容性和低免疫反应性，适用于多种医疗领域[18]。此外，mExo本身也被发现能有效缓解纤维化。Zhang等人的研究表明，给患有异丙肾上腺素诱导的心肌纤维化大鼠口服mExo（悬浮于PBS中）可减少左心室细胞外基质的沉积[19]。与对照组相比，mExo处理组中纤维化标志物（如α-SMA和I型胶原COLI）的表达显著降低[19]。这些结果为纤维化治疗开辟了新途径，mExo可能比其来源细胞更具治疗潜力，但目前用于纤维化治疗的选项有限[20]。然而，mExo是否能治疗LFH尚不清楚。因此，本研究旨在构建一种载有Ato的mExo递送系统，以实现对LFH的更好抗纤维化效果。
生物信息学分析
本研究使用的数据集来自Gene Expression Omnibus（GEO）数据库的GSE113212数据集，包含4个LFH样本和4个对照样本，基于GPL17077平台，样本来源为人体。为了识别LFH样本与正常LF组织之间的差异表达基因（DEGs），我们使用了R 4.2.3版本软件中的“limma”包。设定阈值
0.05且倍数变化|log2(FC)|>1
LFH的生物信息学分析和临床样本分析
根据调整后的|log2(FC)|>1和p值<0.05的阈值，从GSE113212数据集中获得了1393个DEGs，其中870个基因显著上调，523个基因显著下调（图1A）。进一步通过热图展示了上调和下调最显著的150个基因，并在火山图中标记了关键基因（如TGF-β1、COL1、FN1等纤维化相关基因）（图1A，B）。
讨论
腰椎管狭窄（LSS）是一种以脊柱管狭窄为特征的疾病，常由位于脊柱管内的黄韧带（LF）肥大引起。目前该病的主要治疗方法是手术治疗[4]。然而，有效的预防措施和治疗方案的研发仍是该领域的迫切需求。最新研究显示LFH与组织纤维化之间存在密切关系。
结论
本研究表明，Ato、mExo和Ato@mExo通过抑制TGF-β1-SMAD2/3信号通路在体内和体外实验中缓解LFH。特别是Ato@mExo的抑制效果更为显著（图7）。这些发现提示Ato@mExo有望成为LFH早期预防和治疗的候选药物。
作者贡献声明
李健：撰写初稿、资源准备、方法设计、实验实施、数据分析、概念构建。李天阳：数据可视化、结果验证、资源协调。魏金鹏：结果验证、软件应用、资源协调、方法设计、实验实施、数据分析。赵宏琦：资源准备、方法设计、数据分析。徐涛：数据可视化、结果验证、软件应用。陈光志：方法设计、实验实施、数据协调。方轩：实验实施、数据分析。柯文涛：
伦理审批和参与同意
本研究获得了华中科技大学同济医院机构研究伦理委员会（批准编号：TJ-IRB202412198）和华中科技大学同济医院动物研究伦理委员会（[2023] IACUC编号：4068）的批准。
资助
本研究得到了山西省卫生健康委员会中医药管理局科学研究项目（2024ZYY2A020）和中国博士后科学基金会（2024M761050）的联合资助。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢华中科技大学同济医院实验医学研究中心提供的实验仪器和设备。
