伊诺托二醇（inotodiol）和羊毛甾醇（lanosterol）对肥大细胞（mast cells）的稳定作用，是通过泛素（ubiquitin）介导的HMG-CoA还原酶（HMG-CoA reductase）降解实现的

《International Immunopharmacology》：The mast cell-stabilizing effects of inotodiol and lanosterol result from ubiquitin-mediated degradation of HMG-CoA reductase

桦耳霉中提取的C22-羟基甾醇inotodiol通过泛素介导的HMGCR蛋白降解抑制肥大细胞激活，机制涉及微丝动力学异常及LAT信号复合体组装受阻，与lanosterol类似但未影响SREBP转录活性。其效应可通过补充mevalonolactone、farnesol等非甾体异戊烯化物逆转，提示HMGCR调控与异戊烯化途径关键作用。

　　

刘叶 | 雷玛·纳斯卡尔 | 明奎·黄

韩国大田市儒城区大鹤路99号，忠南国立大学药学院免疫学与免疫药理学实验室，34134

摘要

Inotodiol是一种仅存在于桦褐孔菌（Chaga mushroom）中的C22-羟基羊毛甾醇，具有强大的抗过敏和稳定肥大细胞的作用；然而，其作用机制尚未得到充分理解。鉴于其与羊毛甾醇的结构相似性以及羊毛甾醇在调节HMG-CoA还原酶（HMGCR）表达中的已知作用，我们研究了Inotodiol是否通过下调HMGCR来阻断甲羟戊酸途径从而发挥其稳定肥大细胞的效果。Inotodiol和羊毛甾醇处理均降低了HMGCR的表达；然而，与羊毛甾醇不同，Inotodiol仅通过泛素介导的蛋白质降解实现这一作用，而不影响由固醇调节元件结合蛋白（SREBP）调控的转录活性。这两种化合物均抑制了FcεRI诱导的肥大细胞活化，减少了分泌颗粒的释放和TNF-α的产生。从机制上看，这种肥大细胞稳定作用是由于皮质肌动蛋白动态受损，导致肌动蛋白重塑和更新受到阻碍。皮质肌动蛋白动态的受损阻止了LAT信号体的组装，进而抑制了PLC-γ1的活化，而PLC-γ1的活化对于钙依赖性的肥大细胞活化至关重要。重要的是，Inotodiol和羊毛甾醇的稳定肥大细胞的效果可以通过与特定的甲羟戊酸途径产物（如甲羟戊内酯、法尼醇和香叶基香叶醇）共同处理而逆转——但不是角鲨烯——这突显了HMGCR下调及其随后导致的用于生物分子预聚化的特定非甾醇类化合物耗竭的重要性。值得注意的是，Inotodiol仅通过泛素介导的降解调节HMGCR表达这一发现表明，它可能成为更安全的抗过敏治疗候选物，因为它可以避免羊毛甾醇和他汀类药物所观察到的SREBP调控基因的转录重编程。

引言

Inotodiol（INO）是一种仅存在于桦褐孔菌（Inonotus obliquus）中的天然甾醇化合物。INO是通过羊毛甾醇（LAN）在C22位置的羟基化反应合成的。LAN由角鲨烯通过环化反应生成，分别是动物、植物和真菌细胞中胆固醇、植物甾醇和麦角甾醇生物合成的共同前体[1]，[2]。

桦褐孔菌是一种寄生菌，主要生长在亚北极地区的桦树上，包括俄罗斯西伯利亚、加拿大、中国北部和阿拉斯加。几个世纪以来，它一直被用作具有多种健康益处的传统草药，特别是其抗癌、抗氧化、抗糖尿病、抗炎和免疫调节作用[3]。INO的生物活性长期以来一直与桦褐孔菌的已知药理作用一起被研究。最近，我们报告称INO具有与地塞米松（一种用于治疗多种免疫病理状况的典型糖皮质激素药物）相当的抗过敏和抗哮喘活性[4]。此外，它还具有理想的药代动力学特性。当以2 mg/kg的剂量通过橄榄油/水乳剂口服给小鼠时，其Cmax约为80 ng/mL，半衰期（t_1/2）约为6小时，生物利用度超过80%[2]，[5]。

HMG-CoA还原酶（HMGCR）催化从3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）合成甲羟戊酸，是甲羟戊酸途径中的限速酶。HMGCR的表达水平受到泛素介导的内质网相关蛋白降解（ERAD）和固醇调节元件结合蛋白-2（SREBP-2）的转录调控的严格控制。根据Chen等人的研究，LAN通过促进其泛素介导的内质网相关蛋白降解（ERAD）来严格调节HMG-CoA还原酶（HMGCR）的表达[6]，[7]。与LAN不同，24,25-二氢羊毛甾醇（DHLAN）通过泛素介导的ERAD和SREBP-2介导的转录调控来抑制HMGCR的表达。尽管存在这些差异，但由于LAN会迅速被DHCR24转化为DHLAN，在正常细胞中LAN和DHLAN的效果无法区分。

涉及他汀类药物的研究（HMGCR的竞争性抑制剂）强调了MVA途径在免疫调节中的重要性[8]，[9]。这些研究还表明，他汀类药物介导的免疫抑制是由于非甾醇类化合物（如法尼基焦磷酸（FPP）和香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）的缺乏，而这些化合物对于各种小GTP结合蛋白（包括Rabs、Rac和Ras）的预聚化至关重要。基于这些发现，我们研究了INO（LAN的C22-羟基化衍生物）是否也以类似LAN的方式调节HMGCR的表达，如果确实如此，其稳定肥大细胞的作用是否源于阻断MVA途径。

部分摘录

Inotodiol、羊毛甾醇及其他试剂

Inotodiol是根据先前的方法从韩国首尔的Kyungdong Herb Market购买的俄罗斯桦褐孔菌中纯化的[2]，[5]，然后溶解在DMSO中，分装后储存在-80°C直至使用。羊毛甾醇则从美国的Accela公司购买。 本研究中使用的所有其他试剂的详细信息请参见补充材料。

动物

BALB/C（6–10周龄，雄性）小鼠从韩国Osan的SAMTAKO Bio Korea购买，并在SPF条件下饲养。

INO仅通过泛素介导的ERAD下调HMGCR表达

Ino和LAN都能以浓度和时间依赖的方式降低肥大细胞中的HMGCR表达（图1B），同时增加了不同分子量的泛素化HMGCR（图1C）。LAN还降低了HMGCR mRNA的表达水平（图1D）。然而，与LAN不同，Ino对HMGCR mRNA表达没有影响。一致的是，LAN显著降低了经过处理的、截短的SREBP的水平，同时增加了未处理的、全长SREBP的水平（图1E）。

讨论

普遍认为，阻断MVA途径会导致免疫抑制，包括抑制FcεRI诱导的肥大细胞活化[31]，[32]，[33]。然而，该领域的大多数研究主要集中在他汀类药物通过抑制HMGCR的酶活性来阻断MVA途径的效果[34]。在这项研究中，据我们所知，我们首次证明了通过下调HMGCR来限制MVA途径也会导致类似的效应。

CRediT作者贡献声明

刘叶：研究、数据分析、数据管理。雷玛·纳斯卡尔：研究、数据分析、数据管理。明奎·黄：撰写初稿、监督、资金获取、数据管理、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢韩国Daegue KMEDIhub的新药开发中心的Soonghyun Kim博士和CNU药学院的Vinh Le博士分别提供了LAN和INO。我们还要感谢北卡罗来纳大学医学院的Klaus Hahn博士提供了mCherry-Lifeact-7表达载体（Addgene质粒#54491）。我们感谢CNU核心设施的Eun-Young Suh女士在流式细胞术和共聚焦显微镜技术方面的协助。

术语表

HMGCR

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶

SREBP

固醇调节元件结合蛋白

LAT

T细胞激活连接蛋白

FcεRI

Fc Epsilon受体I

PLC-γ1磷脂酶C-γ1

SLP-76

含有SH2结构域的76 kDa白细胞蛋白

ERAD

内质网相关降解FPP

法尼基焦磷酸GGPP香叶基香叶基焦磷酸BMMC骨髓来源的肥大细胞TNF-α肿瘤坏死因子-α1ChIP-qPCR染色质免疫沉淀-定量聚合酶链反应PCA被动皮肤反应