《International Immunopharmacology》：IMM-H004 attenuates neutrophil pyroptosis following ischemic stroke via a CKLF1 dependent mechanism
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中性粒细胞焦亡是脑缺血再灌注损伤的重要机制，IMM-H004通过抑制CKLF1-GSDME通路减少焦亡，改善脑血流和神经功能。
周川|阮圆|曲善和|胡凯超|杨瑞英|李刚|张钊|陈乃宏|楚世锋
内蒙古医科大学药学院，中国内蒙古呼和浩特010000
摘要
背景
中性粒细胞的焦亡被认为是脑缺血-再灌注（I/R）进展中的关键病理生理机制之一。然而，调控这一过程的具体分子机制尚未完全明了，针对这一机制的靶向药物开发也相对较少。
方法
在本研究中，通过阻断大脑中动脉（MCAO/R）建立了一种脑I/R损伤的小鼠模型，并系统地研究了IMM-H004对外周血中性粒细胞焦亡水平、脑血流灌注状态、脑梗死体积和神经行为功能的影响。构建了一种由趋化因子样因子1肽C27（CKLF1-C27）诱导的中性粒细胞焦亡的体外模型，并结合Western blot、免疫荧光染色、流式细胞术等分子和细胞生物学方法，深入探讨了CKLF1诱导的中性粒细胞焦亡的内在分子机制以及IMM-H004的治疗作用靶点。
结果
MCAO/R模型血清中的CKLF1水平随着炎症细胞因子（包括TNF-α、IL-18和IL-1β）的增加而显著升高。进一步实验证实，CKLF1能够以剂量依赖的方式激活Gasdermin E（GSDME）通路并诱导中性粒细胞焦亡。IMM-H004通过抑制GSDME的过度激活，显著减少了中性粒细胞焦亡的发生，从而减轻了脑I/R损伤。此外，CKLF1的缺失显著减少了MCAO/R小鼠的脑梗死体积，有效改善了缺血区域的灌注情况，并显著缓解了模型动物的神经行为缺陷。
结论
IMM-H004通过靶向并抑制CKLF1-GSDME信号通路介导的中性粒细胞焦亡，对脑I/R损伤具有保护作用。
引言
缺血性中风是全球导致残疾和死亡的主要脑血管疾病之一，给社会和家庭带来了沉重负担。据统计，每年约有200万新发中风病例，其中缺血性中风占比高达80%[1]。在临床治疗中，溶栓和血栓切除术是恢复缺血脑组织血流的关键方法。然而，缺血-再灌注（I/R）损伤常常导致患者预后恶化，成为限制治疗效果的重要因素[2]。
脑缺血-再灌注损伤（CIRI）的病理生理机制极其复杂，涉及能量代谢紊乱、氧化应激反应和炎症级联激活等多种病理环节，最终导致不可逆的神经元死亡。这进一步加剧了脑功能缺损[3]、[4]、[5]。其中，炎症反应在CIRI的病理进程中起关键调节作用，而中性粒细胞焦亡作为一种促炎性程序性细胞死亡方式，是缺血后脑组织炎症损伤放大的核心效应机制之一。经典的焦亡途径以炎性小体的整合调节为核心：细胞质中的模式识别受体（PRRs）识别病原体相关分子模式（PAMPs）或损伤相关分子模式（DAMPs），随后与前体pro-caspase-1和含有CARD结构域的凋亡相关斑点蛋白（ASC）结合形成功能性炎性小体。后者激活caspase-1；活化的caspase-1一方面切割Gasdermin D（GSDMD）产生具有膜穿孔活性的N端片段，另一方面切割前体白细胞介素-1β（pro-IL-1β）和前体白细胞介素-18（pro-IL-18）释放到细胞外，从而招募免疫细胞参与先天免疫抗感染反应[6]。最新研究发现，Gasdermin E（GSDME）依赖的焦亡作为一种非经典焦亡途径，其激活机制如下：细胞在外部因子刺激下，活化的caspase-3特异性切割GSDME，释放具有膜破坏活性的N端片段，最终将凋亡程序转化为焦亡表型[7]。先前的研究证实，中性粒细胞激活后发生的焦亡会释放大量促炎细胞因子，形成炎症的恶性反馈循环，显著加重缺血区域的脑组织损伤。因此，靶向调节中性粒细胞焦亡已成为减轻脑梗死严重程度和减少神经功能损伤的潜在治疗策略。
趋化因子样因子1（CKLF1）是一种具有强趋化活性的细胞因子，其核心功能是招募和激活中性粒细胞等免疫细胞[8]、[9]。在脑缺血的病理过程中，中性粒细胞作为最先响应外周炎症信号的免疫细胞，迅速浸润缺血脑组织。其浸润程度和活性状态直接影响疾病进展和患者预后[10]。值得注意的是，多项研究发现，在脑缺血的动物模型和临床患者样本中，CKLF1的表达显著上调[11]、[12]。进一步研究证实，CKLF1可通过调节中性粒细胞的活性促进其在缺血脑组织中的聚集，从而参与缺血后病理损伤的调节[9]、[13]。尽管现有证据表明CKLF1在脑缺血和中性粒细胞介导的炎症反应中起重要作用，但CKLF1是否通过精确调节中性粒细胞焦亡的关键死亡途径参与脑缺血-再灌注损伤的病理过程及其潜在调控机制仍需进一步明确。
IMM-H004是一种具有明确神经保护作用的小分子化合物，近年来在卒中相关研究中受到广泛关注。现有研究表明，IMM-H004可通过CKLF1/CCR4介导的NLRP3炎性小体抑制途径对脑缺血发挥保护作用[14]，并通过调节CKLF1相关的炎症反应缓解脑缺血引起的心肺并发症[15]。此外，该化合物还能抑制脂多糖激活的小胶质细胞释放炎症介质[16]。然而，目前尚不清楚IMM-H004是否能直接调节中性粒细胞焦亡的关键环节，以及CKLF1在IMM-H004调控中性粒细胞焦亡过程中的作用机制仍缺乏直接实验证据。基于上述研究空白，本研究旨在探讨IMM-H004通过CKLF1调节中性粒细胞焦亡的分子机制，以改善脑缺血-再灌注损伤，为缺血性中风的临床治疗提供新的理论基础和潜在靶点。
实验动物
实验中使用的野生型C57BL/6J小鼠购自北京思培富生物技术有限公司（SCXK(JING)2024–0001），Ckl< />1?/?小鼠由中国科学院和北京协和医学院的张钊博士提供。实验所用小鼠为8至10周龄的雄性，饲养在特定无病原体（SPF）条件下（22 ± 1°C，12小时光照-黑暗周期，自由饮水和进食），每组最多5只
脑缺血-再灌注后CKLF1激活的中性粒细胞GSDME依赖性焦亡途径
CKLF1被认为具有趋化因子相关的生物活性，已被提议作为潜在的诊断或预后生物标志物。值得注意的是，脑缺血-再灌注24小时后，小鼠血清中的CKLF1表达显著升高（图1A）。同时，再灌注24小时后血清中的TNF-α、IL-1β和IL-18浓度显著增加（图1B-D）。此外，乳酸脱氢酶（LDH）的释放也显著增加
讨论
脑缺血是全球严重的神经功能障碍和死亡的主要原因之一，对人类大脑健康构成重大威胁。尽管脑I/R治疗技术有所进展，但在临床环境中仍缺乏有效的靶向药物来预防I/R损伤。许多患者在再灌注治疗后仍会出现脑组织损伤，导致卒中后的认知和运动功能障碍
结论
总之，我们的研究结果表明，通过抑制CKLF1与CCR5的相互作用来调节caspase-3/GSDME介导的中性粒细胞焦亡，具有缓解炎症诱导的脑缺血-再灌注损伤的潜力。
作者贡献声明
周川：撰写初稿、数据可视化、方法设计、实验实施、数据分析。阮圆：方法设计、实验实施。曲善和：实验实施。胡凯超：实验实施。杨瑞英：实验实施。李刚：概念提出。张钊：撰写、审稿与编辑、项目管理、资金筹集。陈乃宏：撰写、审稿与编辑、项目管理、资金筹集。楚世锋：监督、项目管理、资金筹集。
资助信息
本研究得到了国家自然科学基金（U2202214、82374060、82130109）和CAMS医学科学创新基金（CIFMS）（2021-I2M-1-020）的资助。
利益冲突声明
本手稿为原创未发表作品，未在其他地方进行过审稿。所有作者同意提交并声明无利益冲突。
