橡胶树铁超氧化物歧化酶基因 HbFSD1受碱性亮氨酸拉链转录因子HbbZIP37的正向调控，能够增强转基因拟南芥的抗旱能力

《International Journal of Biological Macromolecules》：Rubber tree iron superoxide dismutase gene HbFSD1 is positively regulated by the basic leucine zipper transcription factor HbbZIP37 and enhances drought tolerance in transgenic Arabidopsis

橡胶树HbFSD1铁SOD基因通过叶绿体定位增强拟南芥抗旱性，其基因表达受HbbZIP37转录因子调控，激活抗氧化系统清除ROS，为分子育种提供新靶点。

　　

作者：余文才、孔光红、尹拓、张汉尧

单位：中国云南省热带作物研究所橡胶树可持续利用研究重点实验室，景洪市，666100

摘要

橡胶树（Hevea brasiliensis）是一种具有经济价值的热带树种，可生产天然橡胶（顺-1,4-聚异戊二烯）。气候变化导致干旱频率增加，给天然橡胶生产带来了重大挑战。超氧化物歧化酶（SOD）是植物应对非生物胁迫的关键酶，但其在橡胶树中的功能仍不明确。在本研究中，我们从橡胶树中鉴定出一个铁依赖性的SOD基因（HbFSD1）。亚细胞定位分析表明，HbFSD1蛋白定位于叶绿体中。过表达HbFSD1基因通过增强SOD、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）的活性，并减少活性氧（ROS）的积累，提高了转基因拟南芥的耐旱性。此外，GUS染色实验显示干旱胁迫能够通过激活HbFSD1启动子来促进GUS基因的表达。通过酵母单杂交（Y1H）筛选，我们发现一个基本亮氨酸拉链转录因子（HbbZIP37）与HbFSD1相互作用，这一相互作用通过Y1H实验和双荧光素酶报告基因实验得到了进一步验证。这些发现揭示了HbbZIP37转录因子与HbFSD1启动子区域结合的协同机制，从而激活其表达并增强ROS清除能力，最终提高耐旱性。我们的研究为HbFSD1介导的耐旱性提供了重要的分子机制信息，同时为通过转基因策略提高橡胶树的耐旱性提供了潜在的目标基因。

引言

作物在生长和发育过程中会遇到各种胁迫，这些胁迫可分为生物胁迫和非生物胁迫。非生物胁迫包括极端温度、干旱、洪水和高盐浓度，它们会严重限制作物生长并降低产量，对全球粮食安全构成重大挑战[1]、[2]、[3]。非生物胁迫常会破坏植物细胞的稳态，导致活性氧（ROS）的过度积累。在正常环境条件下，植物能够维持较低的细胞内ROS浓度，抗氧化系统的ROS生成和清除处于动态平衡状态[4]、[5]、[6]。然而，当植物受到胁迫时，这种动态平衡会被打破，导致细胞内ROS大量积累。这可能导致膜脂质过氧化、核酸和蛋白质结构损伤，以及碳水化合物合成和代谢受损，甚至细胞死亡，从而影响植物生长和发育，最终降低作物产量[2]、[4]、[7]、[8]。

为了适应恶劣的环境条件，植物在其进化过程中发展出了复杂而高效的抗氧化防御机制，包括酶促和非酶促抗氧化系统[6]。在植物中，酶促和非酶促抗氧化系统协同作用，清除细胞内产生的ROS，从而在恶劣环境下保护植物免受氧化损伤。其中，超氧化物歧化酶（SOD）通过将超氧阴离子（O₂^•-）催化为过氧化氢（H?O?）和氧气（O?）发挥关键作用，被认为是参与ROS解毒的最重要酶之一。SOD是一种金属酶，根据其金属辅因子类型（Cu、Zn、Mn、Fe和Ni），可以分为不同的亚家族，包括Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD和Ni-SOD[10]。

大量研究表明，SOD基因在植物对干旱胁迫的响应中起着核心作用。例如，在葫芦（Lagenaria siceraria）中，LsiSOD基因家族成员在干旱条件下表达显著增加[11]。同样，在丹参（Salvia miltiorrhiza）中，SmCSD1、SmCSD2、SmCSD3和SmMSD2在干旱胁迫早期表达显著上调，随后逐渐下降[12]。在茶树（Camellia sinensis）中，CsCSDs（CsCSD1除外）在PEG4000处理下表达显著上调[13]。在玉米（Zea mays）中，ZmCSD2、ZmCSD5和ZmMSD2在干旱处理后6小时、12小时和24小时分别显著上调，而ZmFSD2则下调[14]。Syed等人[15]报告称，干旱胁迫诱导了抗氧化酶基因（包括SOD、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）的协同上调。在Brassica napus中，大多数BnSOD基因在干旱胁迫下表达显著上调，而BnCSD6和BnFSD1则下调[16]。此外，在Dendrobium catenatum中，DcaSOD基因家族的所有成员在干旱胁迫下均显著上调，DcaFSD2除外[17]。多项研究表明，过表达SOD基因可以增强植物的耐旱性。干旱胁迫会诱导Arachis hypogaea中AhCuZnSOD基因的高表达。进一步的研究发现，转基因烟草品系中的抗氧化酶（SOD、APX和CAT）活性显著高于野生型（WT），存活率也更高，同时H₂O₂和O₂^•-的水平低于WT[18]。根据Xu等人的研究[19]，共表达MeCu/ZnSOD和MeCAT1的转基因木薯品系表现出显著的SOD和CAT活性升高，MDA水平降低。相应地，这些转基因品系的耐旱性显著提高。

天然橡胶（顺-1,4-聚异戊二烯）是一种重要的工业原料和战略物资[20]、[21]、[22]。橡胶树（Hevea brasiliensis）是重要的热带树种，是全球98%以上天然橡胶的来源[23]、[24]、[25]、[26]。根据天然橡胶生产国协会（ANRPC）的数据[https://www.anrpc.org/），2022年全球天然橡胶消费量达到1453万吨，并呈现持续增长趋势[27]。为了满足对天然橡胶日益增长的需求，橡胶树种植已从传统种植区扩展到非传统种植区，包括中国西南部、泰国北部、越南西北部和印度北部[28]、[29]。这些橡胶树种植区受热带季风气候影响，具有明显的干湿季节和降水分布不均的特点。这种气候模式增加了季节性干旱的可能性，对橡胶树的生长和乳胶产量产生负面影响。近年来，全球变暖和极端天气事件的增加导致橡胶树种植区干旱更加频繁和严重。这些环境胁迫推迟了割胶期，显著缩短了橡胶总生产季节，最终导致天然橡胶产量下降。

根据我们之前的研究，一个铁依赖性的超氧化物歧化酶基因（HbFSD1）在干旱胁迫下显著上调[30]。为了进一步阐明HbFSD1基因在橡胶树应对干旱胁迫中的生物学功能和机制，我们克隆了HbFSD1的全长CDS并在拟南芥中过表达；然后，我们系统比较了转基因品系与野生型在干旱胁迫下的表型和生理特征。此外，使用受干旱胁迫的橡胶树叶片构建了酵母单杂交（Y1H）cDNA文库，并筛选了与HbFSD1启动子相互作用的因子。通过酵母单杂交点对点相互作用和双荧光素酶报告基因实验初步分析了HbFSD1在橡胶树中对干旱胁迫的转录调控网络。本研究有望为耐旱橡胶树品种的分子育种提供有价值的遗传资源和理论基础。

植物材料与处理

实验材料选用了在中国云南省热带作物研究所（景洪市）试验田中栽培的优良橡胶树品种GT1。干旱胁迫处理按照先前建立的方法进行[30]、[31]；选择了芽接无性繁殖的GT1橡胶树品系，这些品系生长均匀，发育了一个扩展单位，并在生理期表现出叶片稳定性，随后在人工气候室中栽培

HbFSD1的克隆和生物信息学分析

成功从橡胶树中克隆出一个铁依赖性的SOD基因HbFSD1，其编码序列（CDS）长度为912 bp，编码303个氨基酸（图S1）。多序列比对显示，HbFSD1蛋白与Jatropha curcas的JcFSD（LOC105648679）的同源性最高（83.28%），其次是木薯的MeFSD（LOC110618272）和Ricinus communis的RcFSD1（LOC8275451），分别为77.96%和81.97%（图1a）。系统发育树分析进一步验证了这一结果

讨论

全球变暖显著增加了干旱事件的频率和强度，严重限制了作物的生长和发育，导致农业产量大幅下降[44]、[45]。在干旱胁迫下，植物细胞会产生过量的ROS。活性氧的积累不仅会破坏渗透调节系统，还会导致蛋白质变性失活

结论

在本研究中，我们成功克隆了一个响应干旱胁迫的FeSOD基因（HbFSD1）。亚细胞定位分析表明，HbFSD1蛋白定位于叶绿体中。进一步研究表明，HbFSD1增强了转基因拟南芥植物的耐旱性。此外，HbFSD1启动子可以驱动GUS基因的表达，并在干旱胁迫下增强其表达。共鉴定出48个与HbFSD1启动子相互作用的候选因子

CRediT作者贡献声明

余文才：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原始草稿、软件使用、方法学设计、资金获取、数据分析、概念构思。孔光红：撰写 – 原始草稿、方法学设计、实验研究、数据分析、数据管理。尹拓：数据可视化、软件使用、方法学设计。张汉尧：撰写 – 审稿与编辑、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。