《Metabolic Engineering》：Metabolic Engineering of
Escherichia coli for Uridine-5'-diphosphate
N-acetylglucosamine Production through Salvage Pathway
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本研究通过优化UDP-GlcNAc salvage途径及五个代谢位点，在E. coli BL21(DE3)中构建高效菌株NGP7-1，UDP-GlcNAc产量达319.23 mg/L，为低成本合成奠定基础。
韩松|李伟清|郝东|娜国|曹卓宁|陈瑞|王书|孙建安|毛向钊
中国海洋大学食品科学与工程学院海洋食品加工与安全控制国家重点实验室，青岛，266404，中华人民共和国
摘要
尿苷-5'-二磷酸N-乙酰葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）具有独特的生物活性，是糖胺聚糖和人乳寡糖生产的关键前体。代谢合成被认为是生产UDP-GlcNAc的一种经济策略，然而，其产量仍然无法满足市场需求。在本研究中，选择并优化了以GlcNAc为唯一碳源的 salvage 途径来生产UDP-GlcNAc。此外，还验证了来自尿苷合成途径、ATP合成途径、GlcNAc利用途径以及UDP-GlcNAc下游代谢途径的五个代谢位点。最终，通过结合这些优化措施，获得了NGP7-1菌株，其UDP-GlcNAc产量高达230.72 mg/L。进一步优化GlcNAc的添加量后，UDP-GlcNAc的产量达到了319.23 mg/L，这是单一菌株获得的最高产量。本研究表明了 salvage 途径的优势，并提供了一种高效的UDP-GlcNAc生产菌株，可为其他基于GlcNAc的糖类合成提供参考。
引言
核苷糖是糖的活化形式，由糖部分和核苷二磷酸或核苷一磷酸组成（Dietrich等人，1964；HAO等人，2024；Wei等人，2023）。在这些化合物中，尿苷-5'-二磷酸N-乙酰葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）是最重要的核苷糖，它通过尿苷二磷酸和N-乙酰葡萄糖胺的脱水缩合反应生成（Dietrich等人，1964；Li等人，2017；Okuyama等人，2000）。UDP-GlcNAc在肿瘤免疫调节（Wang等人，2023；Zhang等人，2025）、肝癌代谢调节（Zhou等人，2023）、非酒精性脂肪肝等代谢疾病干预（Junjun等人，2023）以及抗生素（包括抗真菌和抗结核药物）的开发（Chen等人，2023）方面表现出独特的活性。此外，UDP-GlcNAc还是许多生物活性碳水化合物（如糖胺聚糖（Jin等人，2020；Serra等人，2023）和人乳寡糖（HMOs）合成的必要前体。最近的研究证实，糖胺聚糖具有多种有益的生物活性，包括抗菌、降血脂和缓解神经病变。作为人乳中仅次于乳糖和脂肪的第三大固体成分，HMOs已被证实可以促进婴儿大脑发育（Ning等人，2024；Zhu等人，2022b），因此在婴儿配方奶粉中具有很大的应用潜力（Zhu等人，2022a）。因此，对UDP-GlcNAc的需求正在增加。
目前，UDP-GlcNAc的合成主要依赖于酶法（Guan等人，2009；Yu等人，2006；Zhai等人，2012；Zhao等人，2010），但这些方法在降低高价值底物（如UTP和ATP）的成本方面面临挑战，从而显著提高了UDP-GlcNAc的价格。为了解决这个问题，已经利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）将UMP转化为UTP以合成UDP-GlcNAc（Okuyama等人，2000）。尽管这种方法可以降低成本，但转化率低仍然是广泛应用的障碍。为了提高UMP向UTP和AMP向ATP的转化效率，开发了一种五酶无细胞级联反应体系，实现了接近100%的转化效率（Mahour等人，2018）。虽然这种方法降低了UDP-GlcNAc的合成成本，但UMP和AMP仍然价格昂贵且对温度敏感。随着代谢工程的发展，这种通过基因工程技术控制或改变生物体原有代谢途径的技术正在高附加值产品的合成中得到广泛应用。与酶法合成相比，代谢工程可以利用廉价的底物（如葡萄糖），通过原有的细胞内UTP和ATP合成途径进行复杂转化，从而大大降低合成成本。
先前的研究已经成功实现了UDP-GlcNAc的代谢合成。Tabata等人建立了一种利用重组大肠杆菌（Escherichia coli）和氨产生棒状杆菌（Corynebacterium ammoniagenes）组合生产UDP-GlcNAc的新系统。该系统采用了复杂的双细菌共发酵工艺，并使用昂贵的乳清酸作为底物，获得了7.4 g/L的最高产量（Tabata等人，2000）。为了进一步降低成本并简化发酵方法，Gauttam等人使用谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）作为宿主，用葡萄糖合成了UDP-GlcNAc，但产量较低，为58.625 mg/L（Gauttam等人，2021）。此外，Shi等人通过增强壳聚糖寡糖从头合成过程中的 salvage 途径，获得了91.0 mg/L的UDP-GlcNAc产量（Shi等人，2024）。在这些研究中，主要利用葡萄糖作为底物的从头合成途径来降低成本。然而，由于从葡萄糖到GlcNAc涉及多个步骤，从头合成途径的转化率较低，UDP-GlcNAc的产量也有限（Kroef等人，2022；Shi等人，2024）。作为在细胞葡萄糖缺乏时激活的应急途径，直接使用GlcNAc作为底物的 salvage 途径具有反应步骤少和合成效率高的优势（图1）。
在本研究中，以E. coli BL21(DE3)中的UDP-GlcNAc salvage 途径为基础合成UDP-GlcNAc。通过增强UTP循环，优化了UDP-GlcNAc salvage 途径，提高了细胞内尿苷的利用率。随后，针对ATP合成途径、尿苷合成途径、GlcNAc利用途径以及UDP-GlcNAc下游代谢途径，验证了提高UDP-GlcNAc产量的修改策略。最终，通过结合多个代谢位点构建了一种高产量UDP-GlcNAc的工程菌株。
部分内容
质粒构建
本实验室保存了用于过表达（pET28a(+), pACYCDuet-1, pCDFDuet-1, pETDuet-1和pRSFDuet-1）和敲除（pEcCas和pTargetF）的质粒。在本研究中，所有参与代谢修饰过程的基因（表S1），除了nahK、glmU和ppa，均来源于E. coli BL21(DE3)；其中nahK基因来自长双歧杆菌（Bifidobacterium longum），而glmU和ppa来源于多杀巴斯德菌（Pasteurella multocida）。对于质粒构建，首先从模板中提取目标质粒
UDP-GlcNAc合成菌株的构建
UDP-GlcNAc的从头合成途径包括六个反应步骤（图1A），这大大降低了产品的合成效率并增加了代谢修饰的难度。因此，本研究将UDP-GlcNAc的salvage途径（图1A）作为主要合成路线。首先，在体外验证了UDP-GlcNAc salvage 途径的可行性（图S1）。NahK单酶反应的MS结果（图2A）表明该途径是可行的CRediT作者贡献声明
郝东：撰写——审稿与编辑、监督、方法学、资金获取、正式分析、概念构思。毛向钊：撰写——审稿与编辑、验证、监督、项目管理、资金获取、概念构思。陈瑞：方法学。曹卓宁：方法学。孙建安：撰写——审稿与编辑。王书：撰写——审稿与编辑。李伟清：撰写——初稿、方法学、实验研究、数据整理。韩松：撰写——初稿
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（32225039）、中央高校基本科研业务费（202562013）、山东省自然科学基金（ZR2023QC041）、中国博士后科学基金会博士后奖学金（C级，GZC20241615）以及山东省重大科技创新项目（2024ZLGX07）的支持。
