《ACS Biomaterials Science & Engineering》：Design and Synthesis of Peptide-Tagged Cubosome Nanocarriers for the Targeted Delivery of Paclitaxel in EGFR Overexpressing Breast Cancer
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本综述系统阐述了基于脂质的立方体纳米载体（Cubosomes）用于靶向递送化疗药物紫杉醇（Paclitaxel, Pxl）以治疗EGFR过表达乳腺癌的最新研究进展。文章通过响应面法（RSM）优化了纳米颗粒尺寸（~157 nm），并首次采用短肽（YHWYGYTPENVI）作为靶向配体，通过酰胺键偶联实现立方体的EGFR主动靶向。研究表明，肽功能化立方体在EGFR高表达的MDA-MB-468乳腺癌细胞中具有高达75%的选择性摄取，并能显著诱导细胞凋亡；在三维（3D）球体模型和荷瘤小鼠体内模型中均显示出优异的抑瘤效果（靶向组平均肿瘤体积降至330 mm3）且无肝肾毒性，为开发低成本、高特异性的靶向纳米疗法提供了新策略。
引言
脂质纳米颗粒已成为最成功的纳米载体平台之一，超越了许多聚合物和金属系统。其中，液晶脂质纳米颗粒，也称为“立方体”（Cubosomes），因其内部具有二维或三维周期性（如六方或立方对称）的纳米结构而作为纳米治疗剂（包括抗菌和癌症治疗的药物载体）受到关注。与传统的脂质体和其他纳米载体相比，立方体纳米颗粒具有多孔性、结构多样性、稳定性好、高封装效率（得益于其更大的内表面积）以及由食品级材料构成的生物相容性等优势。其两亲性允许封装疏水和亲水性治疗剂，如核酸、显像剂和药物分子。立方体还可实现药物的控释，例如响应pH变化或促进细胞摄取。包括紫杉醇在内的多种化疗药物已在立方体中被封装并研究了其在癌细胞中的功效。
异常的表皮生长因子受体（EGFR）过表达通过促进不受控制的生长、血管生成和转移来驱动肿瘤发生。EGFR靶向疗法，如酪氨酸激酶抑制剂和单克隆抗体，已显示出临床益处。EGFR受体已被广泛用于通过偶联西妥昔单抗（EGFR结合单克隆抗体）将药物靶向递送至癌细胞。此外，一个具有高特异性和EGFR受体结合亲和力的12个氨基酸短肽序列YHWYGYTPQNVI（GE11）也被鉴定出来。本研究采用了其一个类似物（单个氨基酸改变），即YHWYGYTPENVI，该突变肽在EGFR阳性MDA-MB-468细胞中对EGFR受体的靶向效能比GE11高1.6–2.6倍。
材料与方法
立方体的合成、药物封装和肽标记
立方体使用不同比例的甘油单油酸酯（GMO，80–95% w/w）和DSPE-PEG-2000-胺（DSPE，5–10% w/w）共溶于氯仿中合成，混合后在氮气下干燥。确认溶剂完全去除后，加入溶解在无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的Pluronic F-127（F127），其浓度在3.5%至10% (w/w) GMO之间变化以优化尺寸。通过在冰浴条件下使用超声波细胞破碎仪以脉冲模式（1秒脉冲，1秒间隔）在不同时间点（5–55分钟）以65%振幅超声混合物来合成立方体。对于载药立方体，将紫杉醇（Pxl）溶于乙醇，并以不同比例（1–7.5% w/w）加入共溶的脂质混合物中，然后在氮气下干燥。随后遵循相同的立方体合成步骤。将载药立方体置于Slide-A-Lyzer透析盒（3.5K MWCO）中，在25°C的PBS中透析以去除任何未封装的药物。为了分析立方体在体外的定位，将四甲基罗丹明异硫氰酸酯（TRITC，0.5% w/w GMO）与脂质混合物共溶，然后在氮气下干燥。与紫杉醇类似，TRITC标记的立方体在透析盒中透析以去除任何游离染料。对于肽偶联，将1 mM肽溶于Milli-Q水，并加入0.5 mM 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC）和0.5 mM N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）以活化末端羧基。反应在25°C下继续18小时。然后将反应混合物加入立方体中，在肽的羧基和立方体中DSPE的胺基之间形成酰胺键。未偶联的肽通过透析去除。
优化– Box Behnken设计
利用Box-Behnken设计来评估各种参数的影响，并使用Design Expert软件识别显著的单因素、交互作用和二次项。每个因素在三个水平上测试：-1、0和+1，分别代表低、中、高值。该设计包括29次运行，重点关注四个因素：A（GMO用量% w/w）、B（DSPE用量% w/w）、C（F127用量% w/w）和D（超声时间，分钟）。参数范围基于优化前的初步实验选择。
封装效率的测定
将不溶于水的紫杉醇溶于无水乙醇，在氮气干燥前以5% w/w的比例加入GMO:DSPE的脂质混合物中。如上述方法合成立方体。合成后，使用透析法去除未封装的药物。然后将立方体溶解于乙醇:氯仿（1:2）溶液中，使用紫外-可见分光光度计在231 nm波长下检测紫杉醇的吸光度，以确定封装在立方体中的紫杉醇量。封装效率（EE%）使用公式计算。
尺寸和Zeta电位测定
使用动态光散射仪测量颗粒的流体动力学直径。对于测量，立方体的折射率设置为1.46（相对于GMO）。PBS（分散剂）的折射率设置为1.332，粘度设置为0.9053 cP。通过将10 μL立方体加入990 μL PBS的石英比色皿中测量裸立方体（Cbs）和载有Pxl的肽标记立方体（Cbs-Pxl-Pep）的尺寸。背散射角度设置为173°。仪器平衡时间设置为25°C下2分钟，样品通过运行20个循环（每个循环10次运行）进行测量。对于表面电荷，通过将50 μL Cbs-Pxl-Pep加入950 μL去离子Milli-Q水中（在25°C下电阻率为18.2 MΩ·cm），置于一次性Zeta电位池中进行测量，样品在25°C下平衡2分钟。运行参数设置为20个循环，每个循环10次运行。
通过高分辨透射电子显微镜（HR-TEM）进行形态学分析
使用配备BF/DF、CCD探测器和校正光学系统的高分辨透射电子显微镜进行立方体的形态学分析。为此分析，使用了涂有碳膜的200目镍网。将10 μL浓度为80 mg/mL的Cbs-Pxl-Pep加入网格中，并在24°C干燥器中空气干燥过夜。样品在200 kV加速电压下以10000倍放大倍率成像，并使用CCD相机捕获图像。图像使用Fiji ImageJ软件进一步分析。
细胞培养
癌细胞系MDA-MB-468、MDA-MB-231、MCF-7、4T1和非癌性HEK-293最初购自ATCC。细胞在添加了10%胎牛血清（FCS）和5%青霉素/链霉素的杜氏改良培养基（DMEM）中维持培养。细胞在37°C、5% CO2的加湿培养箱中培养。
EGFR表达分析和立方体定位研究
将MDA-MB-468和HEK-293细胞在玻璃包被的培养室玻片上培养。48小时后，弃去培养基，用PBS洗涤细胞，并用4%多聚甲醛（PFD）在24°C固定15分钟。然后用PBS洗涤以去除残留的PFD。接着，用含0.2% Triton X-100的PBS在4°C渗透15分钟。渗透后，用PBS洗涤5次，并用含5% FCS的PBS在4°C封闭1小时。然后将细胞与抗人EGFR小鼠IgG1单克隆抗体（稀释度1:1500）在4°C孵育过夜。随后，细胞与AlexaFluor 488标记的山羊抗小鼠IgG抗体在24°C黑暗中孵育1小时。然后细胞用洗涤缓冲液洗涤数次，并用Hoechst 33342封片。最后使用共聚焦显微镜分析细胞。
对于立方体定位研究，将MDA-MB-468和HEK-293细胞在玻璃包被的培养室玻片中在最佳生长条件下培养18小时。然后用25 μg/mL的TRITC负载立方体（Cbs）（有或无肽偶联）处理细胞。与荧光立方体孵育后，用PBS洗涤细胞以去除外部非特异性附着的立方体，并进一步用Hoechst 33342（5 μg/mL）染色15分钟。接下来，使用共聚焦显微镜在100倍放大倍率下成像。
二维培养中的细胞存活、线粒体膜电位和凋亡测定
将MDA-MB-468和HEK-293细胞以1×104细胞/孔的密度接种在96孔组织培养板中，在37°C孵育18小时。接着，用不同浓度（0–100 μg/mL）的紫杉醇负载立方体（Cbs-Pxl）和Cbs-Pxl-Pep处理细胞12和24小时。处理后，与MTT染料孵育3小时，然后将甲臜晶体溶解在异丙醇中，测量595 nm处的吸光度。此外，为了从形态学确认细胞死亡，将细胞以5×104细胞/孔的密度接种在24孔板中，并用IC50剂量的Cbs-Pxl-Pep处理12和24小时。处理后，细胞与5 μg/mL Hoechst 33342孵育，并在荧光显微镜下分析。
为了测量线粒体膜电位，将5×104细胞/孔的MDA-MB-468和HEK-293细胞接种在24孔板中。然后用IC50剂量的Cbs-Pxl-Pep处理细胞12和24小时。然后细胞用PBS轻轻洗涤，与5 μM JC-1染料在37°C孵育30分钟，然后在荧光显微镜下分析。
使用流式细胞术（FACS）分析凋亡。简要地说，用IC50剂量的Cbs-Pxl-Pep处理MDA-MB-468和HEK-293细胞12和24小时。处理后，用Annexin结合缓冲液洗涤细胞，然后与2 μg/mL Annexin V-FITC在37°C黑暗条件下孵育15分钟。接下来，用PBS洗涤细胞，并在FACS分析前加入1 μg/mL碘化丙啶。
三维球体分析
根据先前工作所述，在低粘附圆底96孔板中培养MDA-MB-468和HEK-293的三维球体。简要地说，将每孔2000个细胞加入含有2.5% Matrigel基质和完全培养基的每个孔中，以360 x g离心15分钟。然后在37°C培养箱中孵育48小时以形成三维球体。然后用IC50剂量的Cbs-Pxl-Pep处理球体24和48小时。处理后，用5 μg/mL Hoechst 33342（核染色）和2 μg/mL碘化丙啶（死细胞染色）染色球体。
为了分析球体中的凋亡，进行蛋白质印迹分析Caspase 3蛋白标记物。简要地说，用IC50剂量的Cbs-Pxl-Pep处理球体48小时。处理后，用PBS轻轻洗涤球体，并与裂解缓冲液一起温和涡旋。按照标准方案收集蛋白质，并进行蛋白质印迹分析。总蛋白质针对Caspase 3和β-肌动蛋白蛋白标记物抗体进行分析。
动物实验
使用6周龄雌性BALB/c小鼠（每只体重约25 g）进行体内研究。所有实验均遵循动物伦理委员会的伦理指南进行。将小鼠饲养在个体通风笼中，提供12小时昼夜循环、自由采食和饮水。实验结束时，按照指南使用二氧化碳窒息法对小鼠实施安乐死。
离体溶血研究
从四只雌性BALB/c小鼠通过眶后静脉丛采集血液至K3-EDTA包被的采血管中。将全血在4°C下以500×g离心5分钟以分离红细胞（RBCs），随后弃去血浆。将RBCs轻轻重悬于150 mM NaCl溶液中，随后重复洗涤并稀释至PBS中的1:50比例。对于对照，使用1% Triton X-100作为阳性对照（100%溶血），而在PBS中孵育的细胞作为阴性对照（0%溶血）。将200 μL RBC悬浮液的三份样品分别用浓度为25、50或100 μg/mL的Cbs-Pxl或Cbs-Pxl-Pep处理，并在37°C、150 rpm的轨道摇床上孵育1小时。孵育后，将样品在500×g离心5分钟以沉淀完整细胞，并收集含有裂解RBCs的上清液。通过测量540 nm处的吸光度来量化溶血。
体内肿瘤靶向研究
将5×105个4T1细胞皮下注射到雌性BALB/c小鼠的乳腺脂肪垫中。2周后，观察到约150 mm3的肿瘤。将18只荷瘤小鼠随机分为3组，每组6只小鼠。第1组（对照）通过尾静脉注射100 μL生理盐水。第2组注射100 μL Cbs-Pxl（25 mg/kg体重），作为非靶向组。第3组注射100 μL Cbs-Pxl-Pep（25 mg/kg体重），作为靶向组。给药重复三次，首次剂量在第1天，第二次在第3天，最后一次在第5天。在整个实验期间监测肿瘤体积和小鼠体重。实验在第24天终止，并使用CO2窒息法对小鼠实施安乐死。收集肿瘤和重要器官，用于H&E染色进行毒理学研究。
结果与讨论
使用Box–Behnken设计优化参数
各种基于甘油单油酸酯（GMO）和植烷三醇的立方体已被配制，并广泛用于药物递送应用。本研究使用了基于GMO的立方体。立方体使用GMO、DSPE-PEG2000-胺的各种组合制成，并由Pluronic F-127稳定。其中，DSPE-PEG2000-胺作为额外的稳定剂，但更重要的是，它能够通过酰胺键偶联实现肽配体的标记。纳米颗粒的尺寸在治疗功效中起着关键作用。据报道，小于30 nm的较小纳米颗粒在循环中保留率低，会从体内快速清除，而大于200 nm的较大颗粒在肿瘤血管系统中穿透能力低，因此治疗功效低。因此，为了达到最佳尺寸范围（100–200 nm），使用了GMO、DSPE和F127的各种组合以及超声时间。
响应面法（RSM）已被用作一种统计方法，用于识别参数与响应之间复杂的定量关系。在本研究中，采用Box-Behnken设计来研究四个参数的影响，即GMO用量（因素A）、DSPE（因素B）、F127用量（因素C）和超声时间（因素D）。最佳条件如下：因素A（GMO用量）- 95% w/w，因素B（DSPE用量）- 5% w/w，因素C（F127用量）- 7% w/w，因素D（超声时间）- 30分钟。在上述最佳条件下，合成的立方体颗粒尺寸为110 ± 10 nm。在几个交互因素中，稳定剂F127用量（因素C）和超声时间（因素D）之间的交互作用被发现对颗粒尺寸影响最为显著。然而，各个因素的波动范围可以从交互作用图中看出。各单因素之间的交互作用以相应的等高线和3D网格图表示。等高线图显示明显的“蓝色”区域和较短的“绿色”、“黄色”和“红色”色调区域。这表明立方体依赖于相应的交互作用。就因素A（GMO用量）而言，在窄的用量范围92.75 (% w/w)–97.25 (% w/w)内观察到明显的‘蓝色’区域。然而，DSPE用量与F127和超声时间之间的交互作用表明，立方体尺寸限制所需的DSPE用量范围比GMO用量更宽。
除了等高线图，交互作用对立方体颗粒尺寸的影响以3D网格图表示得更好。图表显示，立方体的尺寸相当依赖于各参数的中心值。偏离中心值会导致立方体尺寸增加。作为关于等高线图的重要额外推论，我们注意到中心值对于涉及GMO用量的交互作用的重要性。相反，立方体尺寸相对于中心值的变化在涉及DSPE用量的交互作用中相对较低。预测与实际图显示数据分散度较低，证明了模型的重要性。围绕中心值的偏差由扰动图描绘。
方差分析显示了各单因素、交互作用和二次因素的显著性。模型显著性的F值高达24.51（p值 <0.0001）。因素C和因素D的p值分别证明了这些因素在立方体尺寸确定中的重要性。然而，没有发现任何交互因素显著影响立方体的尺寸。相关系数（R2）值和足够的精密度值分别为0.9608和16.5240，证明了模型的显著性。软件建议的编码方程如下。
根据显著因素，修订后的方程如下所示。
根据方程计算预测值。平均百分比误差低于5%（3.465%）。
立方体、紫杉醇封装和肽标记的表征
根据RSM数据，GMO和DSPE的比例为95:5 (w/w%)，F127比例为7% w/w，给出了最佳尺寸110 ± 10 nm和最低的多分散指数（PDI）0.115。PDI值在0.1到0.25范围内表明尺寸分布窄，颗粒具有长期稳定性。有报道显示植烷三醇和DPSE-Peg2000立方体的尺寸稍大，为129 nm，PDI为0.23。紫杉醇是多种癌症（如乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌等）的关键药物和一线化疗治疗。然而，紫杉醇有一些局限性，如溶解度低、肿瘤穿透能力不足以及剂量限制性细胞毒性，使其在临床应用中的效果较差。因此，本研究旨在开发一种递送策略以克服紫杉醇的这些限制。立方体负载了5% w/w的紫杉醇。在先前的工作中，研究了药物负载在立方体制剂中的功效，发现5%的负载量具有最高的摄取和稳定的颗粒尺寸。增加负载量超过5%会导致立方体失去稳定性，观察到更大的尺寸。值得注意的是，已报道的紫杉醇负载立方体尺寸约为250 nm；然而，本研究的优化配方产生了更小的尺寸和更低的PDI值。接下来，通过使用EDC和NHS活化N端氨基酸的羧基，将12肽（Pep）标记在DSPE的胺基上。药物封装和肽标记后，通过DLS测量的立方体的z-平均尺寸为157 ± 20 nm，多分散指数为0.194 ± 0.03。据报道，zeta电位值超过±30 mV的纳米颗粒由于静电排斥而稳定。在本研究中，Cbs-Pxl-Pep的zeta电位值为-31.1 mV，表明稳定性良好。如先前工作所述，这些立方体在24°C和37°C下稳定超过21天。Cbs-Pxl-Pep的紫杉醇药物释放谱显示在48小时内缓慢且持续释放。
FTIR分析是验证药物封装和配体偶联的成熟方法。本研究进行了FTIR分析以验证肽标记和紫杉醇负载。先前研究中报道了酰胺键（C═O和N–H）伸缩在1630–1650 cm–1处的峰。Cbs-Pxl-Pep的FTIR数据显示在1630–1650 cm–1附近存在明显的峰，证实了肽在立方体上的偶联。在裸立方体（Cbs）（即无药物或肽偶联）的情况下，没有观察到类似区域1630–1650 cm–1的显著峰。紫杉醇在731 cm–1和1350 cm–1处有显著峰。这些峰在Cbs-Pxl-Pep光谱中观察到，证实了紫杉醇在立方体中的摄取。据报道，限制药物负载浓度可以提高封装效率，因此将药物负载限制在5%。紫杉醇可以在231 nm波长下通过紫外-可见分光光度计估算，因此，使用相同方法研究封装效率（EE%）。在先前的工作中，立方体对金属有机药物分子的EE为82%。类似地，在最近的一项工作中，GMO基立方体中的槲皮素EE为81.23%。另一份报告显示，紫杉醇的EE为60%。在本配方中，紫杉醇的EE为80 ± 3%，显示了其作为治疗载体的优势。
最后，使用HR-TEM分析了Cbs-Pxl-Pep的形态。如先前工作所述，HR-TEM数据显示立方体具有明显的立方形态，尺寸约为150 nm。放大的视图中可见内部结构，即网格状孔隙。
肽标记立方体在EGFR阳性细胞中的选择性摄取
EGFR受体过表达在多种癌细胞中被观察到，包括肺癌、头颈癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肾癌和胶质瘤。据报道，EGFR的高表达预示着癌症患者的不良预后。西妥昔单抗是针对EGFR受体的单克隆抗体。这种抗体偶联的纳米疗法递送至EGFR过表达乳腺癌已在最近的文献中有所报道。然而，与抗体疗法相关的成本超出了中低收入社会的承受范围。作为替代方案，本研究选择了一个对EGFR受体具有高结合亲和力的12氨基酸肽（YHWYGYTPENVI）。本研究旨在利用该肽将化疗药物递送至EGFR过表达的癌细胞。本研究选择了乳腺癌细胞系MDA-MB-468和非癌性HEK-293细胞进行研究，因为MDA-MB-468是具有极高EGFR表达的癌细胞之一，而HEK-293是EGFR阴性（根据蛋白质图谱数据库）。然而，通过免疫荧光再次确认了这些细胞的EGFR表达。使用FITC标记的EGFR结合抗体，观察到MDA-MB-468细胞显示出高EGFR表达，而在非癌性HEK-293的情况下观察到最小表达。定量分析表明，MDA-MB-468细胞的EGFR过表达高达75%，而HEK-293细胞仅为9%。这与蛋白质图谱数据库中的EGFR转录数据一致，其中MDA-MB-468细胞显示出比HEK-293细胞高约200倍的RNA转录。
为了研究肽标记立方体的靶向效率，在肽偶联前将立方体封装0.25% w/w的TRITC。进一步在EGFR阳性的MDA-MB-468和EGFR阴性的非癌性HEK-293细胞中分别在12和24小时研究了这种红色荧光立方体的定位。EGFR阳性细胞（MDA-MB-468）通过共聚焦显微镜观察到在细胞质区域特异性摄取红色荧光立方体，证明了肽标记立方体的EGFR依赖性摄取。在12小时，观察到约25%的MDA-MB-468细胞有摄取，在24小时增加到75%。相反，在12小时，EGFR阴性的HEK-293细胞对立方体的摄取可以忽略不计。此外，对于HEK-293细胞，随着时间（24小时）的增加，立方体的摄取没有显著增加。这些数据表明，12肽选择性地将紫杉醇封装的立方体有效负载递送至EGFR过表达的癌细胞。
肽标记立方体选择性消除EGFR表达癌细胞
尽管有报道表明基于GMO的立方体具有生物相容性，但由于本研究立方体的独特配方，使用MTT法评估了裸Cbs的毒性。观察到裸Cbs在浓度高达100 μg/mL时，在任一细胞系中均未显示出显著的细胞毒性。接下来，使用MTT法评估了肽标记立方体中紫杉醇靶向递送的疗效。用不同浓度（0–100 μg/mL）的药物负载非靶向立方体（Cbs-Pxl）或药物负载肽标记立方体（Cbs-Pxl-Pep）处理EGFR阳性的MDA-MB-468和EGFR阴性的HEK-293细胞系，并在12和24小时评估细胞活力。非靶向药物负载立方体（Cbs-Pxl）在最高浓度下显示出轻微的细胞毒性，表明Cbs-Pxl在两种细胞系中的非特异性摄取，而Cbs-Pxl-Pep在EGFR表达的MDA-MB-468细胞中显示出显著的细胞活力降低。相反，在EGFR阴性的HEK-293细胞中观察到相对最小的毒性，这与Cbs-Pxl引起的毒性相似。例如，在12小时，60 μg/mL Cbs-Pxl-Pep在MDA-MB-468细胞和HEK-293细胞中的活力分别为71%和87%；而在24小时，60 μg/mL Cbs-Pxl-Pep在MDA-MB-468细胞和HEK-293细胞中的活力分别为47%和83%。这些发现与体外定位数据相关，因为EGFR表达细胞显示出对肽标记立方体的选择性摄取，从而导致高水平的紫杉醇毒性。使用非线性回归曲线分析了Cbs-Pxl和Cbs-Pxl-Pep处理24小时的IC50值。Cbs-Pxl-Pep的IC50值对于MDA-MB-468细胞为53.72 μg/mL，对于HEK-293细胞为119.6 μg/mL，这表12肽成功地将Cbs-Pxl靶向递送至EGFR表达癌细胞的选择性效率。相反，Cbs-Pxl的IC50值在两种细胞中均显著较高，表明在没有肽的情况下非特异性摄取极少。类似的立方体靶向效率在最近的工作中以及另一组使用透明质酸靶向CD44受体过表达癌细胞的研究中已有报道。此外，用MDA-MB-468中的IC50剂量（即53 μg/mL）Cbs-Pxl-Pep处理两种细胞，并用Hoechst 33342染色细胞核观察细胞/细胞核的形态。处理12小时后，25%的MDA-MB-468细胞出现细胞形态变化，处理24小时后进一步增加到90%的细胞，这可能是紫杉醇诱导凋亡的迹象。相反，HEK-293细胞显示出Cbs-Pxl-Pep的影响可以忽略不计，从细胞形态可以看出。单独的紫杉醇在低剂量下对非癌性HEK-293细胞也具有细胞毒性，因此没有特异性。为了进一步验证Cbs-Pxl-Pep对EGFR受体的特异性，评估了另外两个基于RNA转录具有不同EGFR表达水平的细胞系。根据蛋白质图谱数据库，MDA-MB-231细胞具有中等水平的EGFR RNA转录，而MCF-7细胞是EGFR阴性。用Cbs-Pxl-Pep处理MCF-7和MDA-MB-231细胞12小时和24小时，并使用MTT法记录IC50值。Cbs-Pxl-Pep在MDA-MB-231细胞中显示出与MDA-MB-468细胞相似的细胞毒性效应，IC50值为85.8 μg/mL。与MDA-MB-468相比，IC50值的轻微增加可能归因于MDA-MB-231中EGFR表达低于MDA-MB-468。相反，MCF-7细胞与HEK-293类似，对Cbs-Pxl-Pep的存活率更高，IC50值为137.2 μg/mL。对于进一步的研究，选择
