《ACS Nano》：NanoScript-Enabled Nonviral Transient Repression of Phosphatase and Tensin Homolog for Axonal Regeneration and Central Nervous System Injury Repair
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这篇综述介绍了一种利用NanoScript-PTEN（NS-PTEN）纳米颗粒平台实现非病毒、瞬时的PTEN基因抑制，以治疗脊髓损伤（SCI）的新策略。该平台通过激活PI3K/AKT/mTOR通路，重塑抑制性微环境，有效促进了轴突再生、髓鞘修复和功能恢复，为中枢神经系统（CNS）再生医学提供了精确、安全的潜在治疗手段。
1. 引言
脊髓损伤（SCI）是一种致残性神经系统疾病，其治疗方法有限，现有的疗法主要针对症状，而非解决再生的复杂细胞与分子屏障。这些障碍包括抑制性胶质瘢痕形成、慢性神经炎症、神经元内在再生能力缺陷以及血脊髓屏障（BSCB）破坏。为了克服这些限制，研究者开发了NanoScript-PTEN（NS-PTEN）纳米平台。该平台可递送合成转录因子，瞬时抑制磷酸酶与张力蛋白同源物（PTEN）的表达。PTEN负向调节PI3K/AKT/mTOR信号轴，该通路是神经元存活和轴突生长的关键决定因素。通过降低PTEN水平，NS-PTEN解除了对该促生存通路的抑制，从而促进受损脊髓中的神经元再生。通过将靶向PTEN启动子的DNA结合域（DBD）、转录抑制模块（RD）和核定位信号（NLS）整合到金纳米颗粒（AuNP）支架上，NS-PTEN实现了对PTEN抑制的瞬时控制，在重新激活促再生信号的同时，最大限度地降低了与永久性基因沉默相关的肿瘤发生风险。
2. 结果与讨论
2.1. NS-PTEN的开发与表征：用于SCI修复的非病毒基因沉默平台
NanoScript平台旨在模拟天然转录因子（TF）的结构与功能，实现精确的基因调控。为了抑制PTEN，该系统整合了三个关键模块化结构域：（i）靶向PTEN启动子区的DNA结合域（DBD），（ii）阻断转录机制组装的抑制域（RD），以及（iii）确保细胞和核内递送的核定位序列（NLS）。通过模拟这些结构域，NS-PTEN选择性结合PTEN启动子内的p53反应元件，有效抑制其转录活性。该平台利用由吡咯（Py）和咪唑（Im）基团组成的发卡多聚酰胺作为DBD，靶向PTEN启动子序列。表征实验证实了该平台的成功合成：熔解温度偏移实验显示DBD与目标启动子序列结合后热稳定性显著增加；透射电子显微镜（TEM）图像显示了纳米颗粒的形貌；动态光散射（DLS）测量显示功能化后流体动力学直径有所增加，但仍足够小以允许通过核孔复合体；Zeta电位测量显示功能化后电位显著增加。此外，PrestoBlue细胞活力实验证实NS-PTEN对人诱导多能干细胞神经祖细胞（hiPSC-NPC）衍生的神经元无毒。这些结果验证了NS-PTEN的成功合成及其选择性、安全地与PTEN启动子序列结合的能力。
2.2. NS-PTEN轴突再生能力的体外验证：PTEN沉默与PI3K/AKT/mTOR通路激活
在hiPSC-NPC分化的成熟神经元模型中，NS-PTEN处理显著降低了直接靶点Pten的基因表达，同时激活了下游基因Akt、mtor和gap43的表达，并降低了gsk-3β的表达。在脂多糖（LPS）诱导的炎症模型中，蛋白质印迹分析显示NS-PTEN显著下调了pTen蛋白，并上调了PI3K和pAKT/AKT比率。细胞凋亡实验和细胞活力检测表明，NS-PTEN降低了LPS诱导的神经元凋亡并提高了细胞活力。使用mTOR抑制剂雷帕霉素（Rapamycin）进行共处理，完全逆转了NS-PTEN诱导的pmTOR/mTOR比率升高和轴突再生，证实了其作用机制是通过经典的PI3K-AKT-mTOR信号轴。在由TNF-α和IFN-γ诱导的人星形胶质细胞炎症模型中，NS-PTEN处理同样降低了PTEN蛋白水平和pGSK-3β/GSK-3β比率，并显著下调了促炎细胞因子il-6、pTen和il-1β的mRNA表达，而对stat3的表达没有显著影响。这些数据表明，NS-PTEN在体外能有效抑制PTEN、激活PI3K/AKT/mTOR通路、促进神经元存活和轴突生长，并减少星形胶质细胞的促炎细胞因子释放。
2.3. NS-PTEN的顺行递送通过瞬时PTEN抑制在挫伤SCI模型中促进皮质脊髓束再生
通过颅内注射将NS-PTEN递送至感觉运动皮层，免疫组化证实其优先被神经元（而非星形胶质细胞）内化，并存在于NeuN和p-S6阳性的皮质细胞核内。在胸段脊髓挫伤模型大鼠中，于损伤后立即向感觉运动皮层注射NS-PTEN。RT-qPCR分析显示，NS-PTEN显著降低了损伤部位的Pten表达，而对pi3k表达无显著影响。脊髓横截面成像显示，NS-PTEN处理组损伤部位头侧的皮质脊髓束（CST）轴突密度更高。矢状面图像分析表明，与AuNP对照组相比，NS-PTEN处理显著增加了CST轴突穿过病灶区域的距离。然而，在观察期内，未观察到BBB评分显示的运动能力明显增强，这可能是因为CST轴突未能在短时间内完全穿越损伤部位与下级神经元重新建立连接。
2.4. 用于模拟轴突损伤和评估NS-PTEN逆行内化的微流控平台
研究者设计了包含两个由30微米窄桥连接的平行微通道的微流控装置，以空间分离小鼠神经干细胞（mNSC）的胞体室和轴突末梢室。将NS-PTEN添加至轴突末梢所在的远端室，观察到NS-PTEN促进了显著的轴突向外生长，并可通过逆行运输机制被神经元摄取。在利用毒胡萝卜素（Thapsigargin, TG）模拟的轴突退行性变模型中，预先用NS-PTEN处理再暴露于TG的神经元表现出明显的轴突损伤，而先暴露于TG再用NS-PTEN处理的神经元则显示出显著的神经元挽救和轴突再生，其再生指标与AuNP处理的对照组无显著差异。这些发现证实NS-PTEN不仅能增强健康神经元的轴突再生，还能挽救受神经毒性损伤的神经元的轴突生长能力。
2.5. SCI后通过NS-PTEN的核靶向递送实现急性期神经元PTEN下调
为了评估NS-PTEN在体内的治疗潜力，研究者采用了一种靶向的鞘内注射策略。在胸段脊髓挫伤后，将NS-PTEN直接注射到损伤中心及头尾侧约1毫米的三个特定实质部位。通过活体成像监测，观察到NS-PTEN在损伤部位的荧光信号在注射后48小时达到峰值，随后逐渐衰减，至第7天显著降低，符合预期的清除动力学。系统药代动力学分析显示NS-PTEN主要蓄积于肝脏和脾脏，并在7天内被有效代谢和清除。细胞水平上，NS-PTEN的核进入在损伤后第1天（DPI-1）即可在病灶中心的损伤神经元中检测到。至DPI-3，NS-PTEN处理组的PTEN蛋白水平较AuNP对照组显著降低，证实了高效快速的基因敲低。纵向重建显示，NS-PTEN的运输不局限于病灶腔，在注射后48小时可观察到从损伤中心向头侧延伸的荧光梯度。到DPI-28，PTEN抑制逐渐减弱，仅部分降低，这与NS-PTEN介导的基因沉默预期的时间窗口相符，体现了其瞬时的安全性。
2.6. 靶向鞘内递送NS-PTEN可改善SCI后的运动功能
多模态行为学评估显示，NS-PTEN治疗在SCI后带来了显著的功能益处。在DPI-28，通过足迹分析和步态跟踪观察到，NS-PTEN处理组大鼠的后肢伸展和爪部接触明显改善，步态轨迹更连续、交替。定量步态分析显示，NS-PTEN显著改善了异常增加的步宽和完全丧失的步长，并部分保留了腓肠肌肌肉重量。机械痛觉敏感性测试（电子Von Frey测试）显示，NS-PTEN显著提高了伤害性刺激的撤回阈值。BBB评分评估显示，从DPI-7开始，NS-PTEN处理组的运动功能恢复显著优于未处理的损伤组和AuNP对照组。转棒实验（Rotarod test）在DPI-28时未显示组间统计学显著差异，但NS-PTEN组在慢性期表现出渐进性改善的趋势。基于DeepLabCut的无标记姿态估计分析显示，NS-PTEN处理显著改善了后肢摆动幅度。旷场实验（OFT）表明，NS-PTEN处理显著增加了总运动距离、平均运动速度和自由站立时间。运动诱发电位（MEP）记录显示，SCI组皮质脊髓束传导完全阻断，而NS-PTEN处理部分恢复了刺激诱发的反应，提示功能性的皮质脊髓传导得到部分重新激活。
2.7. NS-PTEN重编程细胞内信号以构建促再生的微环境
为阐明功能恢复的分子机制，研究者在损伤后第4天对脊髓损伤中心进行了蛋白质印迹分析。结果显示，NS-PTEN处理显著降低了PTEN蛋白表达，并恢复了AKT和mTOR的磷酸化水平，同时调节了GSK-3β的磷酸化。RT-qPCR分析显示，NS-PTEN成功逆转了损伤诱导的神经保护基因（如mTOR和Creb-1）抑制，同时显著减弱了关键促炎介质（如IL-6、TNF-α和iNOS）的mRNA表达。酶联免疫吸附试验（ELISA）进一步证实，NS-PTEN处理显著降低了损伤部位促炎细胞因子IL-1β的浓度，并恢复了抗炎细胞因子IL-10的蛋白水平至接近基线水平。这些发现表明，NS-PTEN全面重塑了免疫微环境，将其从神经毒性、促炎状态转变为促再生状态。
2.8. NS-PTEN在损伤后保留脊髓结构并促进神经发生
在损伤后第28天（DPI-28），组织学评估显示NS-PTEN治疗显著减轻了继发性组织退化。苏木精-伊红（H&E）染色显示，NS-PTEN组的病变面积远小于SCI组。Luxol Fast Blue（LFB）染色分析表明，NS-PTEN处理组的髓鞘化程度显著高于SCI对照组。免疫荧光染色使用神经元标志物TUJ1和髓鞘标志物髓鞘碱性蛋白（MBP）进一步评估了神经发生和髓鞘再生。高倍成像显示，NS-PTEN处理组神经元胞体形态更有序，轴突与髓鞘共定位更明显。定量分析证实，NS-PTEN显著提高了损伤区域的TUJ1和MBP阳性面积百分比，表明其促进了早期神经元分化和保存，以及动态的髓鞘再生。
2.9. NS-PTEN增强脊髓损伤后的轴突完整性、髓鞘再生和再生性出芽
MBP和神经丝蛋白（NF）的双重免疫荧光染色显示，NS-PTEN处理组显著改善了脊髓微结构。高倍视图显示，MBP信号更密集、连续，NF阳性轴突纤维排列良好、向损伤核心延伸。空间荧光强度分析证实，NS-PTEN组的MBP和NF信号强度最高，且分布连续，提示解剖连接性改善。对再生相关蛋白GAP43和5-羟色胺能（5-HT）纤维的染色显示，未处理损伤组中两者均显著减少且碎片化，而NS-PTEN处理组则表现出密集、纵向排列的GAP43+纤维和丰富的5-HT+轴突延伸至先前失神经支配的区域。平均荧光强度分析证实，NS-PTEN显著增加了GAP43和5-HT信号。
2.10. NS-PTEN重塑炎症微环境以促进神经保护和恢复血脊髓屏障完整性
免疫荧光成像显示，NS-PTEN治疗显著改变了损伤脊髓的炎症结构。胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色显示，NS-PTEN处理显著减弱了损伤边缘的反应性星形胶质细胞增生，减少了胶质瘢痕的致密边界形成。离子钙接头蛋白1（Iba1）染色显示，NS-PTEN显著降低了小胶质细胞的活化。在损伤和AuNP对照组中，病灶核心以CD68+的活化巨噬细胞为主，而NS-PTEN处理组则表现出CD68+浸润减少和CD163+细胞显著增多，表明巨噬细胞表型向修复性（M2型）极化转变。TUNEL染色显示，NS-PTEN处理显著减少了病灶区域的凋亡细胞数量。此外，NS-PTEN处理显著增强了脑源性神经营养因子（BDNF）的表达，并促进了血管内皮标志物CD31和紧密连接蛋白Occludin的表达，表明其促进了血管生成并恢复了血脊髓屏障（BSCB）的完整性。
2.11. NS-PTEN通过免疫“冷”微环境促进胶质桥接
一个有趣的发现是NS-PTEN组中STAT3通路上调，该通路通常与星形胶质细胞增生相关。形态学上，NS-PTEN处理组的GFAP+星形胶质细胞呈线性、层状排列，平行于脊髓纵轴，这与未处理对照组中混乱的网状屏障形成鲜明对比，产生了“胶质桥接”效应。重要的是，这种星形胶质细胞活化发生在免疫“冷”微环境中。qPCR分析显示，NS-PTEN治疗显著减弱了促炎标志物iNOS以及关键炎症因子IL-6和TNF-α的表达。ELISA分析也证实了脑脊液中IL-1β的抑制和IL-10的保存。因此，NS-PTEN通过阻断这些上游炎症驱动因子，有效地将STAT3信号与神经毒性解耦，可能驱动了修复性的“A2样”星形胶质细胞程序。
2.12. 全身毒性评估证明了NS-PTEN的转化安全性
为确保NS-PTEN的转化潜力，研究者对其全身毒性进行了全面评估。急性和慢性期的血清生化和血液学分析显示，全身给药NS-PTEN未引起可检测的脱靶毒性，肝肾功能标志物和血清白蛋白水平均保持在生理参考范围内，与假手术组无异。损伤后第4天（DPI-4）的血液学分析显示了SCI典型的急性期反应（淋巴细胞减少和粒细胞增多），而NS-PTEN治疗减轻了这种炎症偏移。至DPI-28，所有队列的血液学参数均恢复至基线水平，排除了慢性骨髓毒性。H&E染色进行的组织病理学检查显示，主要器官（心、肝、肾）组织形态结构保存完好，未见坏死、充血或炎性浸润迹象。这些数据共同证实NS-PTEN具有良好的生物相容性，既不引起急性全身炎症，也不引起慢性器官病变。
3. 结论
本研究成功证明了NS-PTEN在治疗脊髓损伤（SCI）方面的潜力，它能同时解决SCI的外在抑制性微环境和成年神经元内在再生能力有限的双重障碍。NS-PTEN是一种基于非病毒纳米颗粒的平台，可实现PTEN的瞬时、靶向抑制。在挫伤SCI大鼠模型中，NS-PTEN通过激活PI3K/AKT/mTOR通路、减少胶质瘢痕密度、促进轴突再生，从而带来了显著的功能恢复。至关重要的是，NS-PTEN实现了这些治疗效果，同时避免了与病毒整合或组成型基因敲除相关的风险。PTEN通过NS-PTEN的调节促进了损伤后神经元存活、增强髓鞘再生、减轻继发性损伤，并通过确保瞬时抑制解决了致癌性担忧。通过顺行和逆行途径递送，NS-PTEN在微流控和体内模型中有效激活了再生通路和轴突再生。体外验证表明，NS-PTEN在hiPSC-NPC衍生的神经元中抑制PTEN并激活下游Akt/PI3K/mTOR信号，驱动轴突生长。功能测定证实了其在神经毒素损伤神经元中的疗效。在体内，逆行递送促进了急性神经元核定位和PTEN抑制（DPI-4），进而促成了多方面的恢复（DPI-28），包括神经发生、髓鞘再生和炎症减轻，最终改善了行为学结果。PTEN在DPI-28时的恢复证实了该平台的瞬时作用特性。NS-PTEN调节神经元-胶质细胞相互作用的能力进一步凸显了其治疗潜力，因为PTEN抑制在星形胶质细胞中减少了促炎因子TNF-α，同时增加了神经保护因子IL-10。这种调节平衡了炎症消退、轴突完整性和髓鞘再生，强调了PTEN在SCI恢复中的关键作用。通过刺激BDNF分泌、减少小胶质细胞活性和增强内皮细胞及紧密连接蛋白的表达，NS-PTEN促进了神经保护和血管生成，并减轻了神经炎症。在DPI-28，NS-PTEN显著减小了胶质瘢痕面积，使轴突能够穿透病灶并有效再生。行为学测试进一步验证了这些结果，显示NS-PTEN组从DPI-3开始出现显著的运动功能恢复，到DPI-28更为明显。与现有的PTEN抑制方法相比，这使NS-PTEN成为一种有前景的治疗策略。
尽管NS-PTEN显示出巨大潜力，但一些局限性仍需进一步研究。虽然PTEN抑制是瞬时的，但长期抑制仍可能存在肿瘤发生风险。不过，先前研究表明，PTEN缺失虽然是肿瘤发生的关键步骤，但通常需要额外的基因扰动才能诱发侵袭性癌症。此外，未来的工作可以集中于将NS-PTEN封装在能够穿过血脊髓屏障的脂质制剂中，以最大限度地减少对患者的伤害并增强转化潜力。同样，含有神经元靶向抗体的脂质组成可以进一步提高递送的精确性和有效性。尽管存在这些局限性，NS-PTEN瞬时调节基因表达的能力为针对SCI多因素病理的组合疗法开辟了新途径，从而推进了神经退行性疾病、组织修复和个性化医学的再生策略。总之，本研究开创了利用NS-PTEN进行瞬时PTEN抑制的先河，在促进神经发生、髓鞘再生和抗炎作用的同时，减轻了持续PTEN抑制相关的风险。NS-PTEN与临床模型的兼容性及其解决SCI多重挑战的能力，凸显了其转化前景。通过实现精确和瞬时的基因调控，NS-PTEN为治疗先前难以治愈的疾病提供了先进的治疗工具，在SCI恢复领域迈出了重要的一步。
