《Molecular Pharmaceutics》：Cell-Penetrating Peptides and Supercharged Proteins: A Comprehensive Protocol from Isolation to Cellular Uptake
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本文提供了一份关于细胞穿膜肽融合蛋白和超电荷蛋白从表达、纯化、表征到细胞摄取分析及功能验证的标准化、可复现的全流程方案。作者以甲基CpG结合蛋白2为模型，整合了天然蛋白纯化、动态光散射缓冲液筛选、活细胞高内涵成像、成像流式细胞术等技术，旨在提高该领域研究的可重复性，并为基于蛋白递送的基础研究和治疗开发提供实用框架。
引言
细胞穿膜肽是一类具有细胞转导能力的氨基酸序列，其摄取机制尚未完全阐明，但通常涉及与质膜的相互作用及随后的内吞作用。HIV-1来源的TAT肽已被广泛应用于将治疗性蛋白递送至细胞内。超电荷蛋白是一类净电荷相对于其分子量异常高的蛋白质，包括天然存在和人工设计的变体。它们同样具有细胞递送能力，其内在无序区域在介导细胞摄取中发挥关键作用。尽管已有一些关于CPP-FPs和SPs的方法学研究，但该领域仍缺乏标准化的、可重复的工作流程，现有方法在表征和摄取分析方面也存在局限性。
材料与方法
本协议概述了一个三步核心工作流程：
蛋白表达与纯化：CPP-FPs和SPs通常在大肠杆菌中表达，使用pET等细菌表达质粒，编码序列两端带有亲和标签以利于纯化。本研究采用天然条件下的纯化策略，依次使用Strep-TactinXT亲和层析和凝胶过滤层析（尺寸排阻色谱）。为去除核酸和脂多糖污染，分别采用了高盐洗涤和Triton X-114相分离法。
动态光散射表征：使用动态光散射进行缓冲液筛选，以优化蛋白的长期储存条件。通过监测样品强度和流体力学半径，评估蛋白的稳定性和聚集倾向。最终确定的最佳储存缓冲液系统为DPBS，含200 mM NaCl、10%甘油和0.05% CHAPS，pH 7.2。
活细胞成像与定量分析：使用活细胞荧光显微镜初步观察蛋白转导。关键步骤包括使用肝素洗涤去除膜结合蛋白，以确保对内在化蛋白的准确观察。随后，采用成像流式细胞术和ImageXpress Pico系统对细胞摄取进行定量分析。这两种技术能更好地区分膜结合信号与内在化信号，提供比传统板式读数更准确的结果。
内吞机制研究：通过共孵育内体破坏剂（如氯喹、蔗糖）或预孵育内吞抑制剂（如阿米洛利、吲哚美辛），并利用ImageXpress Pico量化摄取变化，来探究内吞作用在CPP-FP/SP摄取中的参与情况及具体路径。
SP中CPP样基序的定位：使用CPPSite 2.0软件扫描SP（如MeCP2）的氨基酸序列，寻找潜在的CPP样基序。通过克隆候选基序与eGFP的融合蛋白并检测其摄取能力，以及构建缺失该基序的SP突变体进行功能丧失验证，来鉴定对SP内化至关重要的基序。
功能验证：通过免疫共沉淀实验验证内化蛋白（如MG和TMG）在细胞内能否招募已知的结合伙伴（如HDAC3），从而确认其功能性。
结果
1. 天然纯化与缓冲液筛选产生可溶、非聚集的SPs
在天然条件下表达和纯化获得了可溶的MG和TMG蛋白。SDS-PAGE和Western blot显示其迁移慢于预期。动态光散射缓冲液筛选确定了长期储存的最佳条件，在此条件下，所有构建体在37°C和25°C下72小时内均保持稳定，强度与流体力学半径比值接近1.0，表明具有高长期稳定性和抗聚集性。
2. 基于图像的活细胞分析工具成功评估并量化CPP-FP/SP摄取
活细胞成像显示，经肝素洗涤后，可清晰观察到4 μM的MG和TMG被NIH3T3细胞内化并积累在异染色质焦点上，而作为阴性对照的minMG则无内化活性。未经肝素处理时，大量膜结合蛋白信号会干扰对内在化的判断。研究证实，细胞固定会显著高估蛋白内化水平（约25%），因此不适用于此类研究。
成像流式细胞术和ImageXpress Pico定量分析均显示TMG的摄取水平比MG高约50%，而minMG的摄取可忽略不计。ImageXpress Pico检测到的阳性细胞核数量比成像流式细胞术高一个数量级，这主要因为后者能更严格地区分未结合与内在化信号，从而提供了更准确但更保守的摄取估计。
3. ImageXpress Pico定量为CPP-FP/SP内吞运输提供洞见
与内体破坏剂氯喹或蔗糖共孵育后，MG和TMG的摄取均增加，表明内体参与了其内化过程。预孵育巨胞饮抑制剂阿米洛利显著降低了MG和TMG的摄取，而小窝蛋白介导的内吞抑制剂吲哚美辛仅对TMG的摄取有轻微降低。这些结果表明，巨胞饮是MeCP2衍生CPP-FP/SP的主要内吞途径，而小窝蛋白介导的内吞可能作为TMG的次要途径。
4. SP序列扫描揭示对SP摄取至关重要的CPP样基序
使用CPPSite 2.0扫描MeCP2序列，发现了多个候选CPP样基序。通过排除法和实验验证，鉴定出一个关键基序（富含精氨酸、赖氨酸和脯氨酸）。将该基序与eGFP融合后表达纯化，并在较高浓度下证实其具有细胞摄取能力。相应地，缺失该基序的MeCP2突变体的摄取能力显著降低，证实了该基序对于SP内化至关重要。
5. 免疫共沉淀可作为有价值的CPP-FP/SP功能验证工具
CoIP实验证明，内化到NIH3T3细胞中的MG和TMG能够成功招募其已知结合伙伴HDAC3，表明细胞内蛋白水平足以进行蛋白质-蛋白质相互作用，从而验证了内化蛋白的功能活性。必要的对照实验，如用重组蛋白加标未处理的细胞裂解物以及检测核提取物中胞质污染标志物（β-tubulin），确保了实验的可靠性。
讨论与结论
本研究提出了一套用于CPP-FP和SP研究的综合标准化工作流程。强调了在天然条件下纯化以获得正确折叠蛋白的重要性，以及使用动态光散射进行缓冲液优化以保障蛋白稳定性的必要性。研究证实，基于活细胞的成像技术（尤其是成像流式细胞术）对于准确量化蛋白摄取和区分膜结合与内在化信号至关重要，而固定方法则会引入偏差。机制研究表明，内吞作用，特别是巨胞饮，是所研究蛋白的主要内化途径。序列分析揭示了SP中存在对摄取起关键作用的CPP样基序，建立了SP与CPP之间的功能联系。最后，通过功能验证实验（如CoIP）证实了内化蛋白在细胞内的生物活性。该集成方案结合了蛋白质生物化学、结构分析和活细胞成像的先进技术，有望提高CPP和SP相关研究的可重复性和可靠性，为基于蛋白质的疗法和下一代生物制剂的开发提供有力支持。
