《Molecular Pharmaceutics》：Liposome-Encapsulated Carfilzomib as a Radiosensitizer in Solid Tumors
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本文综述了通过脂质体递送系统包裹蛋白酶体抑制剂卡非佐米（CFZ），旨在提高其在实体瘤放射治疗中的增敏效果与临床应用潜力。研究通过体外与体内实验（采用4T1乳腺癌模型），证实脂质体CFZ能有效抑制DNA双链断裂修复（通过γ-H2AX foci检测）并增强肿瘤放射敏感性（剂量增强因子=1.26），同时改善药物水溶性及体内耐受性，为实体瘤的放化疗联合治疗提供了新的纳米治疗思路。
引言
据估计，2025年将新增超过200万癌症病例。现代癌症治疗手段包括化疗、靶向治疗、放疗和手术切除等。放疗用于近50%的癌症治疗，但作为单一疗法很少能治愈。因此，放疗常与化疗、免疫治疗等其他治疗方式联用。本研究旨在探究蛋白酶体抑制剂卡非佐米（CFZ）作为放射增敏剂在实体瘤治疗中的应用潜力。CFZ是一种四肽环氧酮共价蛋白酶体抑制剂，目前已被FDA批准用于多发性骨髓瘤。它不可逆地结合并抑制20S蛋白酶体的β5亚基，这是泛素-蛋白酶体系统（UPS）的关键组成部分。蛋白酶体抑制可影响一系列细胞过程，包括细胞周期、DNA修复、凋亡调节和多种致瘤通路。例如，蛋白酶体抑制剂与拓扑异构酶抑制剂联用，相较于单独使用拓扑异构酶抑制剂，能显著增加DNA双链断裂的数量，而DNA双链断裂是放疗介导的细胞死亡的主要驱动因素。有趣的是，CFZ还被研究作为免疫抑制性肿瘤微环境的潜在调节剂。有研究发现，蛋白酶体抑制剂（包括卡非佐米）能促进骨髓源性巨噬细胞分泌促炎细胞因子，并促使肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）从M2表型向M1表型转化，这与T细胞向肿瘤的浸润增加相关。局部放疗可诱导远处转移灶缩小，这一过程称为远隔效应，被认为是由局部治疗部位产生的免疫反应驱动的。M2巨噬细胞会限制放疗产生远隔效应所需的全身性抗肿瘤免疫。本研究假设，卡非佐米将通过干扰DNA修复以及通过系统性免疫激活和缩小远处肿瘤（远隔效应）来改善实体瘤的放疗效果。为了测试其潜在的免疫治疗效果，我们在免疫健全的Balb/cJ小鼠上使用了双肿瘤远隔效应模型。此外，卡非佐米采用瘤内注射，以便更好地控制对远处肿瘤的真实远隔效应。卡非佐米的一个关键问题是其有限的水溶性。对于瘤内注射，我们选择了脂质体载体，因其具有高生物相容性并能增溶CFZ等疏水性药物。临床上，CFZ与环糊精一同给药，但本研究希望避免环糊精辅料已知的免疫刺激效应，因此使用脂质体载体进行给药。
材料与方法
细胞培养使用从ATCC获得的4T1细胞，在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中，于37°C、5% CO2环境下培养。克隆形成实验用于测定CFZ的放射增敏能力。细胞接种于6孔板，用15 nM CFZ预处理6小时后接受X射线照射（2、4、6或8 Gy），照射18小时后更换新鲜培养基，培养7-10天后计数菌落（≥50个细胞）。生存曲线通过GraphPad Prism软件拟合非线性二次方程。γ-H2AX foci滞留实验用于检测DNA双链断裂。细胞用15 nM CFZ处理6小时后接受5 Gy照射，18小时后固定并用抗γ-H2AX抗体染色，通过共聚焦显微镜计数每个细胞的foci数量。脂质体卡非佐米通过薄膜水化法和探头超声法制备，脂质组成为DOPC/胆固醇/DSPE-mPEG2K/CFZ的摩尔比为62:30:5:3（PEG-LP）。脂质体表征包括使用动态光散射测定粒径和Zeta电位，使用HPLC测定包封效率，并通过透析实验与环糊精制剂比较药物释放动力学。体外功效通过MTT法测定细胞毒性，并使用Amplite荧光蛋白酶体20S活性测定试剂盒评估CFZ介导的蛋白酶体抑制。体内研究采用Balb/cJ小鼠的双侧肿瘤远隔效应模型。小鼠左右腹侧分别接种4T1细胞作为“原发”和“远处”肿瘤。治疗组包括：对照组、仅放疗组、仅CFZ组、CFZ+放疗组。治疗首日，小鼠瘤内注射1 mg/kg CFZ（脂质体制剂），6小时后，原发肿瘤接受8 Gy照射（用铅屏蔽保护小鼠其余部分，特别是远处肿瘤）。一周后进行第二次相同治疗。定期测量肿瘤体积，并在首次治疗16天后处死小鼠，收集组织进行H&E染色和肺转移结节计数。统计显著性使用双尾t检验（比较两组）或单因素ANOVA（比较多组）确定。
结果
放射增敏与γ-H2AX foci滞留
克隆形成实验表明，与未处理细胞相比，经CFZ处理的4T1细胞在照射后存活率下降（在37%存活率下的剂量增强因子为1.26）。γ-H2AX免疫荧光实验显示，CFZ与放疗联合处理的细胞，其每个细胞的γ-H2AX foci平均数显著高于单独放疗组，而单独CFZ处理与未处理对照组相比无显著差异。这表明CFZ扰乱了DNA双链断裂的修复通路。
CFZ负载脂质体的表征与体外功效
成功合成了CFZ负载的脂质体，其平均流体动力学直径约为127.4 nm，Zeta电位约为-15.6 mV，包封效率为63.9%。透析实验显示，PEG-LP制剂的药物释放比环糊精制剂更缓慢。MTT实验表明，在48小时处理中，脂质体CFZ在多个浓度下比游离CFZ具有更强的细胞毒性。蛋白酶体活性测定证实，与游离CFZ相比，脂质体CFZ处理的细胞蛋白酶体活性降低更明显，表明其生物活性得以保持甚至增强。
体内实验：原发肿瘤
在双腹侧肿瘤模型中，接受CFZ联合放疗的小鼠，其原发肿瘤的生长受到显著抑制，效果优于单独CFZ或单独放疗。曲线下面积（AUC）分析也得出相同结论。
体内实验：远处肿瘤与肺转移
相比之下，对于已建立的远处肿瘤，CFZ联合放疗并未观察到显著的生长抑制效果（即未产生明显的远隔效应）。然而，在肺转移方面，CFZ联合放疗处理组形成的转移结节数量相较于对照组和单独CFZ组有所减少，但与单独放疗组相比无统计学显著差异。这表明联合治疗可能在一定程度上抑制了新转移灶的形成，但对已形成的远处实体瘤影响有限。
体内实验：治疗耐受性
研究中使用的治疗方案耐受性良好。各组小鼠体重在整个研究过程中无显著差异。接受放疗的小鼠脾脏重量显著轻于未接受放疗的小鼠，但CFZ的加入并未引起脾脏重量的额外变化。对收获的器官进行H&E染色，未发现与对照组相比有重大组织形态学改变。
讨论
化学放射治疗是癌症治疗的关键手段。典型的放射增敏化疗药物包括蒽环类药物、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物、铂类药物和烷化剂，这些药物的一个关键共性是直接与DNA相互作用。蛋白酶体是另一个潜在的放射增敏靶点。UPS在受损和错误折叠蛋白的细胞回收中至关重要，也在许多细胞活动（包括DNA修复）的调控中发挥关键作用。本研究首次提供了CFZ可作为放射增敏剂的初步证据。克隆形成实验证实CFZ预处理降低了细胞的克隆存活率，γ-H2AX foci滞留实验则支持CFZ通过干扰DNA修复通路发挥增敏作用。CFZ的水溶性差是其临床应用的障碍。本研究使用脂质体作为递送载体，成功提高了CFZ的溶解度、稳定性和体外功效。在体内，CFZ联合放疗显著抑制了原发肿瘤的生长，验证了其放射增敏作用。尽管本研究未能观察到对远处肿瘤的显著远隔效应（这可能与4T1模型的高度免疫抑制性、放疗分割方案（8 Gy × 2）不足以有效启动免疫、或其他免疫抑制因素如PD-1过表达有关），但联合治疗减少了肺转移负担，提示其对抑制转移有一定潜力。治疗耐受性良好，未引起系统性毒性。这些发现为CFZ作为实体瘤放射增敏剂的进一步研究奠定了基础，未来方向包括在人类细胞系和异种移植模型中进行验证、优化放疗剂量与分割方案、以及与免疫检查点抑制剂或免疫刺激剂联用以增强全身抗肿瘤反应。
结论
本研究表明，脂质体包裹的卡非佐米（CFZ）在实体瘤模型中可作为有效的放射增敏剂，为增强化学放射治疗的疗效提供了一种有前景的策略。通过体外和体内分析，我们证明CFZ能增强辐射诱导的DNA双链断裂滞留，并降低4T1癌细胞的克隆存活率，这与蛋白酶体抑制介导的DNA修复通路破坏相一致。脂质体配方显著改善了CFZ的溶解度、生物活性和耐受性，使得局部瘤内给药成为可能且无系统性毒性。在体内，CFZ与电离辐射联合应用显著抑制了原发肿瘤的生长，并减少了肺转移负荷，尽管未观察到对远处肿瘤的强效远隔效应。总之，这些发现确定了通过脂质体CFZ抑制蛋白酶体作为一种可行的放射增敏策略，并为进一步探索纳米载体介导的放射免疫治疗联合方案奠定了基础。
