将人类汗液进行皮内注射可以增强针对汗液中溶解的抗原所产生的特异性IgG抗体

《ASA Monitor》：Intradermal injection of human sweat enhances production of specific IgG against antigens solved in the sweat

本研究通过给HR-1无毛小鼠皮肤内注射或表皮贴片给药，发现汗液中的成分可能通过真皮递送增强抗原特异性IgG的诱导，而表皮给药则无显著差异，提示汗液泄漏至真皮可能通过激活抗原递呈细胞促进免疫反应。

　　

致编辑：

汗液在维持皮肤稳态方面起着关键作用，它通过调节体温、滋润皮肤表面以及利用其抗菌肽和蛋白酶来抵御感染性微生物。然而，汗液也是加剧特应性皮炎（AD）和引发胆碱能荨麻疹（CholU）症状的主要因素。这两种疾病都涉及对汗液抗原的I型超敏反应[¹]，其中主要抗原被确定为MGL_1304，这是一种由皮肤寄居真菌Malassezia globosa分泌的蛋白质[^2,3]。在这些疾病中，可以观察到汗液从汗腺泄漏到皮肤中[⁴]。最近的研究表明，汗管/腺上皮中紧密连接结构的关键成分Claudin-3的生成不足可能导致汗液渗入真皮[⁵]。

人体汗液中含有多种细胞因子[⁶]，如IL-1α、IL-1β和IL-31，以及来自Malassezia的抗原。因此，汗液泄漏可能会引发超出I型超敏反应的多种生物反应。IL-1通过促进T细胞与抗原呈递细胞的相互作用并增强T细胞的激活来增强适应性免疫[⁷]。Dai等人[⁶]报告称，人体汗液中的IL-1α、IL-1β和IL-31可以激活表皮角质形成细胞[⁵]。然而，据我们所知，目前还没有研究探讨人体汗液对真皮的影响。

鉴于AD患者体内针对多种抗原的IgE水平升高，我们研究了人体汗液是否可能通过表皮或通过汗腺和汗管的泄漏直接将抗原传递到真皮，从而促进对体外抗原的皮肤致敏。

我们从7名健康志愿者处收集了汗液样本，使用0.2毫米过滤器（Pall Corp., WA, USA）进行消毒后合并用于实验。作为汗液抗原致敏模型，使用了卵清蛋白（OVA）作为免疫原，并将其与原始汗液样本一起或单独使用来研究汗液中除抗原以外的成分对致敏的影响。OVA以1 μg/μl的浓度溶解在生理盐水中或汗液中后使用。将指定量的免疫原通过贴片（用于表皮给药）或微针（通过适配器调整以到达真皮层，用于真皮给药）施用于HR-1无毛小鼠的背部（图1A）。为了确认每种给药方法的抗原位置，将FITC标记的OVA施用于小鼠背部，并在荧光显微镜下观察用DAPI染色的皮肤冷冻切片。结果表明，通过表皮贴片和真皮注射，抗原分别成功进入了表皮和真皮（图1B）。抗原在2周的时间内分6次给药，每次给药前后都收集了血液样本。使用ELISA方法检测血清中的OVA特异性IgG和IgE水平（图1C）。

图1：

OVA免疫和诱导HR-1无毛小鼠（Hoshino Lab.动物公司，茨城县）血清中OVA特异性IgG的产生方案。(A) 对于表皮致敏，将200 μl的样本放置在无菌CARELEAVES贴片（NICHIBAN，东京）上，并贴在背部皮肤的2个位置。对于真皮致敏，使用34-G微针（TERUMO，东京）的注射系统将2 μl的样本注射到背部皮肤的10个位置。(B) 用FITC标记的OVA（Thermo Fisher，马萨诸塞州沃尔瑟姆）确认每种免疫方法所传递样本的位置。箭头指示进入组织的FITC-OVA。绿色：FITC-OVA，蓝色：DAPI。(C) 在2周内每周3次将生理盐水、汗液（OVA 1 μg/μl）/生理盐水或OVA（1 μg/μl）/汗液施用于HR-1无毛小鼠。(D) 免疫开始后第18天通过ELISA检测血清中的OVA特异性IgG浓度。蛋白质水平表示为平均值±标准差（n = 3）。数据采用双因素ANOVA分析进行评估（双因素ANOVA；交互作用，P = 0.027，η2 = 0.43；95%CI，0.04–1.00），基于Brown-Forsythe检验（F = 1.8998，P = 0.1363），随后进行Bonferroni多重比较检验。统计显著性设定为***P < 0.005，*P <0.05）。

在真皮给药组中，当OVA溶解在汗液中时，OVA特异性IgG的产生量更高（582.8 ± 317.0 ng/ml），而溶解在生理盐水中时则较低（159.3 ± 137.9 ng/ml）（图1D）。在表皮给药组中，OVA/生理盐水和OVA/汗液组之间的OVA特异性IgG产生量没有差异（分别为137.2 ± 118.9 ng/ml和129.3 ± 132.8 ng/ml），与OVA/生理盐水的真皮给药组相比也没有差异（159.3 ± 137.9 ng/ml）（图1D）。OVA特异性IgE水平未达到ELISA的检测限（数据未显示）。由于这些数据分析是基于N = 3进行的，因此需要通过更大规模的实验进一步验证数据。

我们没有测量进入表皮和真皮的OVA量。然而，通过生理盐水中的OVA进行的表皮和真皮给药所诱导的抗OVA IgG水平相当。因此，无论是通过表皮还是直接通过真皮给药，都可以诱导出抗OVA IgG；但是，只有当汗液与抗原一起直接输送到真皮时才观察到了佐剂效应。鉴于人体汗液中存在细胞因子（如IL-1α和IL-1β），汗液进入真皮可能会激活抗原呈递细胞（如树突状细胞和巨噬细胞），并促进它们与T细胞的相互作用，从而诱导抗原特异性抗体的产生[⁷]。未能检测到OVA特异性IgE可能是由于HR-1小鼠的非Th2遗传背景和/或本研究中使用的较短免疫方案所致。

研究表明，屏障功能减弱是AD中抗原致敏的风险因素[⁸]。然而，关于CholU的皮肤屏障功能的数据有限。另一方面，无论是AD还是CholU，都有报道指出汗液会渗入真皮[^4,5]。因此，AD和CholU中对汗液抗原的致敏可能是由于汗腺和/或汗管的屏障功能受损所致，而不是表皮角质形成细胞的问题。增强和/或恢复汗腺和汗管的屏障功能可能是预防AD和CholU中过敏反应发展和/或加重的新治疗方法的目标。需要进一步分析，以了解汗液中的特定细胞因子和蛋白质如何影响真皮免疫反应，包括IgE的产生，这需要使用更多的小鼠模型和更长的免疫周期。

致谢

我们感谢捐赠汗液的志愿者，以及Tomoko Kawaguchi提供的出色技术支持。特别感谢Minoru Hattori在详细统计分析方面所做的努力。

本研究得到了JSPS KAKENHI项目（项目编号JP20K17319）的支持。

伦理声明

汗液样本的临床研究是在获得书面知情同意后进行的。研究方案获得了广岛大学生物医学与健康科学研究生院的伦理委员会批准（委员会主席：Hitoshi Okamura博士）（机构批准编号：E-2018-1420）。动物实验也获得了同一大学的动物实验委员会批准（机构批准编号：A22-196）。

利益冲突

作者没有利益冲突。