r2d2基因的单等位基因敲除会影响埃及伊蚊（Aedes aegypti）对Mayaro病毒的抗病毒RNA干扰（RNAi）反应及其繁殖能力

《Parasites & Vectors》：Monoallelic knockout of r2d2 affects the antiviral RNAi response to Mayaro virus and the reproductive potential in Aedes aegypti

r2d2基因在Ae. aegypti中与性别决定基因连锁，完全敲除致死，单敲除影响RNAi下游RISC形成，导致Mayaro病毒复制增加，但未影响dicer-2功能，且病毒感染时piRNA通路活性上升补偿了部分缺陷。

　　

摘要

背景

Aedes aegypti是多种人类病原性虫媒病毒的重要传播媒介。RNA干扰（RNAi）是蚊子体内的主要抗病毒免疫途径。抗病毒RNAi的关键步骤包括：由dicer-2将长双链RNA（dsRNA）切割成siRNA双链；在R2D2的帮助下将siRNA双链装载到Argonaute-2上；通过整合含有siRNA的Argonaute-2形成RISC（RNA干扰复合物）；以及RISC介导的同源病毒RNA的靶向和降解。在这里，我们构建了一个r2d2敲除蚊子品系，以研究RISC装载复合体（RLC）形成过程中RNAi功能受损如何影响Ae. aegypti对虫媒病毒的感染。

方法

我们使用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除了Ae. aegypti中的r2d2基因。通过杂交实验研究了r2d2功能缺失对蚊子的繁殖能力和生育力的影响。利用时间序列RT-qPCR检测方法监测了Mayaro病毒（Togaviridae）的感染情况以及RNAi途径相关基因的表达水平，并通过小RNA分析技术确定了ΔR2D2^(+/-±)蚊子中的小RNA含量。

结果

研究发现，在Ae. aegypti中，r2d2基因位于1号染色体上的性别决定位点。无法生成纯合的ΔR2D2^(?/?)蚊子，这表明r2d2功能的完全丧失对Ae. aegypti是致命的。观察结果表明，r2d2的功能不仅参与RNAi过程，还影响蚊子的繁殖能力和生育力，可能与其卵泡发育有关。r2d2的单等位基因突变会促进MAYV的复制，在感染MAYV的蚊子中r2d2的表达也有所增加。ΔR2D2^(+/-±)蚊子感染MAYV后，假定的vpiRNA含量也有所上升。然而，r2d2功能的受损并未影响dicer-2的活性，因为ΔR2D2^(+/-±)蚊子与非转基因对照组之间的21个核苷酸（nt）siRNA谱没有差异。

结论

r2d2基因是RNAi途径中的关键基因，目前无法生成r2d2功能完全缺失的蚊子。r2d2的单等位基因突变会损害dicer-2下游的siRNA途径，在RLC形成阶段产生影响。在感染MAYV的蚊子中，这种siRNA途径的缺陷通过增强piRNA途径的活性得到补偿，从而在10天内缓解了病毒复制的增加。

图形摘要

背景

Aedes aegypti是多种人类病原性虫媒病毒的重要传播媒介。RNA干扰（RNAi）是蚊子体内的主要抗病毒免疫途径。抗病毒RNAi的关键步骤包括：由dicer-2将长双链RNA（dsRNA）切割成siRNA双链；在R2D2的帮助下将siRNA双链装载到Argonaute-2上；通过整合含有siRNA的Argonaute-2形成RISC（RNA干扰复合物）；以及RISC介导的同源病毒RNA的靶向和降解。在这里，我们构建了一个r2d2敲除蚊子品系，以研究RISC装载复合体（RLC）形成过程中RNAi功能受损如何影响Ae. aegypti对虫媒病毒的感染。

方法

我们使用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除了Ae. aegypti中的r2d2基因。通过杂交实验研究了r2d2功能缺失对蚊子的繁殖能力和生育力的影响。利用时间序列RT-qPCR检测方法监测了Mayaro病毒（Togaviridae）的感染情况以及RNAi途径相关基因的表达水平，并通过小RNA分析技术确定了ΔR2D2^(+/-±)蚊子中的小RNA含量。

结果

研究发现，在Ae. aegypti中，r2d2基因位于1号染色体上的性别决定位点。无法生成纯合的ΔR2D2^(?/?)蚊子，这表明r2d2功能的完全丧失对Ae. aegypti是致命的。观察结果表明，r2d2的功能不仅参与RNAi过程，还影响蚊子的繁殖能力和生育力，可能与其卵泡发育有关。r2d2的单等位基因突变会促进MAYV的复制，在感染MAYV的蚊子中r2d2的表达也有所增加。ΔR2D2^(+/-±)蚊子感染MAYV后，假定的vpiRNA含量也有所上升。然而，r2d2的受损并未影响dicer-2的活性，因为ΔR2D2^(+/-±)蚊子与非转基因对照组之间的21个核苷酸（nt）siRNA谱没有差异。

结论

r2d2基因是RNAi途径中的关键基因，目前无法生成r2d2功能完全缺失的蚊子。r2d2的单等位基因突变会损害dicer-2下游的siRNA途径，在RLC形成阶段产生影响。在感染MAYV的蚊子中，这种siRNA途径的缺陷通过增强piRNA途径的活性得到补偿，从而在10天内缓解了病毒复制的增加。

图形摘要