利用结晶石英二氧化硅颗粒验证体外与体内肺部炎症模型的一致性研究

《Particle and Fibre Toxicology》：Alignment of in vitro and in vivo pulmonary inflammation models using crystalline quartz silica

本文通过系统性比较，探索了Calu-3与单核细胞来源巨噬细胞(MDM)共培养体外模型与啮齿动物体内模型在暴露于结晶石英二氧化硅(DQ12)颗粒后炎症反应的关联。通过延长暴露时间至7天，并与OECD吸入测试指南的动物实验后暴露期对齐，研究发现两种模型在特定炎症生物标志物(IL-1β、IL-6、IL-8)的基因表达上呈现正相关性。该研究凸显了优化时间线与终点选择对于提升体外模型预测能力的重要性，并支持其在颗粒诱导的肺部炎症危害评估中的价值。

　　

背景与目的

在吸入毒理学和监管风险评估领域，系统性比较体外与体内模型被越来越多地用于评估体外肺模型的相关性和预测能力。本研究旨在使用标准参考材料——结晶石英二氧化硅颗粒(DQ₁₂)，在已建立的体外与体内肺部模型中比较炎症终点。为了更好地对齐暴露时间线，研究将体外评估时间点从常规的24小时延长至7天，以匹配经济合作与发展组织(OECD)吸入测试指南中推荐的动物实验后暴露期。研究采用了一个经过协调的体外共培养模型，该模型由人支气管上皮细胞系(Calu-3)和人单核细胞来源的巨噬细胞(MDM)组成，用于评估DQ₁₂颗粒暴露后的反应。

研究方法

研究中使用的DQ₁₂颗粒是一种特征明确的石英参考材料，其组成是100%的二氧化硅(SiO₂)，α-石英的结晶度为89.3%。通过扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)分析显示，颗粒粒径分布广泛，从100到1000纳米不等，并具有尖锐的边缘特征。动态光散射(DLS)测量结果与此一致。颗粒悬浮液按照Nanogenotox方案制备，并最终在细胞培养基中稀释，以达到对培养在0.9 cm²插入式培养皿上的细胞产生10到300 μg/cm²的暴露剂量。

体外模型采用了Calu-3细胞与MDM的共培养体系。Calu-3细胞首先在水下培养7天，然后转移到空气-液体界面(ALI)再培养7天以分化。在ALI培养的第15天，将分化的MDM加入到Calu-3单层上，形成共培养体系。在ALI培养的第16天，通过“准ALI”方式进行颗粒暴露。该方法将一小体积的颗粒悬浮液直接滴加在共培养物的顶端，使颗粒沉积，模拟口咽吸入的方式，以确保精确控制沉积剂量。暴露后，在多个时间点（24小时、3天、7天）评估各项指标。

主要的检测终点包括：

1. 1.
   细胞毒性：通过测量乳酸脱氢酶(LDH)的释放来评估。
2. 2.
   上皮屏障完整性：通过跨上皮电阻(TEER)测量和紧密连接蛋白1(TJP1)的基因表达来评估。
3. 3.
   炎症反应：通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测量白介素(IL)-6、IL-8和IL-1β的蛋白分泌水平，并通过实时定量聚合酶链反应(qPCR)分析其基因表达。
4. 4.
   巨噬细胞数量：使用DiD荧光染料进行活细胞染色和成像计数。
5. 5.
   紧密连接和细胞骨架形态：通过ZO-1抗体、罗丹明-鬼笔环肽和DAPI染色，并使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)进行观察。

体内实验使用8周龄的雄性Fisher 344大鼠。通过口咽吸入法给予大鼠8 mg/kg的DQ₁₂颗粒（相当于每只大鼠约2 mg）。根据OECD指南，在暴露后24小时、3天和7天处死动物并收集样本。评估的终点包括：支气管肺泡灌洗液(BALF)分析（细胞计数、分类计数、LDH和总蛋白）、肺组织病理学（H&E染色）以及肺组织中炎症相关基因（包括IL-1β、IL-6、IL-8的同源物及其受体）的表达分析。

研究结果

体外模型表征与颗粒表征

Calu-3细胞在ALI条件下形成了紧密的单层，TEER值保持在400–800 Ω•cm²的高水平，表明屏障功能良好。在共培养体系中，通过活细胞染色计数，MDM的密度约为16,863 ± 3,570 个细胞/cm²。DQ₁₂颗粒的表征确认其粒径分布和形态符合预期，在细胞培养基中未观察到明显的聚集。

急性暴露（24小时）的影响

体外共培养模型暴露于DQ₁₂24小时后，即使在高剂量（高达300 μg/cm²）下，也未观察到明显的细胞毒性（LDH释放）或上皮屏障完整性受损（TEER和TJP1基因表达）。在炎症反应方面，仅在最高剂量（200和300 μg/cm²）下检测到IL-6分泌的显著增加，而IL-1β和IL-8的分泌水平以及IL-1β、IL-6和IL-8的基因表达均未发生显著变化。这表明短期的体外暴露可能不足以引发广泛的、可测量的炎症反应。

延长暴露（3天和7天）的影响

为了探究延迟的炎症反应，研究将体外暴露后的观察时间延长至3天和7天，并与体内实验结果进行对比。

• •
  细胞毒性与组织损伤：在体外，即使暴露7天后，也未检测到显著的细胞毒性或屏障功能损伤。然而，在大鼠体内实验中，暴露3天后即观察到BALF中LDH活性显著升高，表明存在细胞损伤。肺组织H&E染色进一步证实了体内模型的明显组织损伤：暴露24小时后出现细胞浸润，3天后浸润加剧并形成斑片状区域，7天后虽然细胞浸润减少，但肺泡结构发生改变，出现组织破坏迹象。
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  炎症反应：
  • •
    细胞因子分泌：在体外，暴露于100 μg/cm²DQ_{12后3天和7天，IL-8和IL-6的分泌水平均显著增加。}
  • •
    免疫细胞招募：在体内，暴露后3天和7天，BALF中的总免疫细胞数量显著增加，包括淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞，这通过Diff Quick染色得到证实。这与体外观察到的IL-8（一种强效的中性粒细胞趋化因子）分泌增加相一致。
  • •
    基因表达相关性：通过斯皮尔曼秩相关系数分析体外与体内基因表达数据，发现了一些具有一致性的趋势。IL-1β基因在体外（10和100 μg/cm²）和体内暴露7天后均显著上调，且低剂量(10 μg/cm²)下显示出中等程度的正相关性(r_s=0.50)。IL-6基因在两种模型中均于暴露3天后显著上调，7天后回落至基线水平，尽管趋势一致，但统计分析显示相关性较弱。IL-8（人类）及其在大鼠中的同源物/受体分析显示，体外IL-8基因持续上调，在100 μg/cm²剂量下于第3天达到峰值；在体内，IL-8受体CXCR2的基因表达在暴露3天和7天后均显著上调。选择CXCR2作为与体外IL-8比较的最佳体内对应物。

讨论与结论

本研究成功地将体外暴露时间线延长并与体内实验对齐，识别出了在体外肺模型与体内数据之间具有相关性的炎症生物标志物（IL-1β、IL-6、IL-8/CXCR2）。尽管在细胞毒性和组织损伤方面观察到差异（体外模型未显示，而体内模型明显），但在关键的炎症通路事件上，两种模型展现出时间依赖性的相似反应模式。

研究强调了几个关键点对于提升体外模型预测价值的重要性：

1. 1.
   暴露方案的优化：延长暴露后观察时间至数天，对于捕捉像DQ₁₂这类材料引发的延迟或渐进性炎症反应至关重要。仅凭24小时的短期评估可能会低估材料的致炎潜力。
2. 2.
   终点选择的生物学相关性：研究基于不良结局通路(AOP 173)选择终点，关注从早期炎症到肺纤维化的关键事件，如促炎细胞因子释放和免疫细胞招募，这使得体外数据与体内病理生理过程更紧密地联系起来。
3. 3.
   模型与暴露方法的适用性：研究所用的Calu-3/MDM共培养模型已在多个实验室间验证，具有可转移性和可重复性。“准ALI”暴露方法提供了对沉积剂量的精确控制，便于与口咽吸入的体内方法进行直接比较，尽管两种方法的沉积剂量存在数量级差异。
4. 4.
   剂量设置的挑战：研究指出，由于体外模型复杂度较低，其细胞暴露场景与体内复杂器官环境存在差异，因此通常需要更高的体外剂量才能引发可测量的效应。未来的研究需要通过更精确的体外-体内外推(IVIVE)和计算剂量学来弥合这一差距。

总之，这些发现证明了优化的、时间线对齐的体外模型在评估颗粒诱导的肺部炎症方面的价值，支持其在危害评估中的相关性，并为减少动物测试、推进新方法评估体系(NAM)在吸入毒理学监管决策中的应用提供了实验依据。