《Radiation Oncology》：CXCR2 affects sensitization of radioresistant HPV-negative head and neck squamous cell carcinoma cells by ABT-263
编辑推荐：
本文探讨了ABT-263（一种BH3-mimetic药物）联合放射治疗对HPV阴性头颈鳞状细胞癌（HNSCC）细胞系的影响，揭示了CXCR2信号通路在调控细胞对联合治疗反应中的关键作用。研究发现，ABT-263能有效诱导细胞凋亡、减少放射诱导的衰老细胞，但在不同细胞系中其放射增敏效果存在差异。研究证实，这种差异与CXCR2的表达变化密切相关：在CXCR2下调的细胞中，ABT-263能实现显著的放射增敏；而在CXCR2表达上调的细胞中，需要同时抑制CXCR2才能获得增敏效果。这为靶向衰老细胞及CXCR2信号以克服HNSCC放疗抵抗提供了新的策略思路。
背景
头颈鳞状细胞癌（HNSCC）是常见的恶性肿瘤，其中人乳头瘤病毒（HPV）阴性亚型常表现出更强的放射抵抗性，导致局部复发率高。放疗会诱导部分肿瘤细胞进入衰老状态，而非直接死亡。这些衰老细胞通过分泌一系列促炎因子、趋化因子等，形成衰老相关分泌表型（SASP），特别是NF-κB依赖的SASP成分，可激活与放疗抵抗紧密相关的信号通路，促进肿瘤细胞的存活与再生。此外，衰老细胞的另一个特征是抗凋亡蛋白（如Bcl-2家族成员）的上调，使其能抵抗细胞凋亡。因此，清除衰老细胞或抑制其促生存信号成为克服治疗抵抗的新思路。ABT-263是一种口服生物可利用的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂，能够靶向并清除衰老细胞。本研究旨在探究ABT-263与放疗联合，是否能够克服HPV阴性HNSCC细胞的治疗抵抗，并探索其背后的分子机制。
材料与方法
研究使用了两种已知具有高放射抵抗性和高衰老诱导水平的HPV阴性HNSCC细胞系：Cal33和UPCI:SCC040。细胞培养后，接受不同剂量的X射线照射（1-6 Gy）和不同浓度的ABT-263处理（Cal33使用1 μM，UPCI:SCC040使用5 μM）。随后，通过一系列功能学和机制学实验进行评估，包括：通过流式细胞术检测Annexin V/PI染色以评估细胞活力和凋亡；通过检测衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性来量化衰老细胞比例；利用Western Blot分析凋亡相关蛋白（如Pro-Caspase 9、Bcl-xL、Bax）和衰老标记物（Lamin B1）的表达变化；通过qRT-PCR和ELISA检测SASP相关因子（如IL-1α、IL-1β、IL-8、CXCL1等）及趋化因子受体CXCR2在基因和蛋白水平的表达；通过克隆形成实验评估长期增殖能力，即放射增敏效果；通过共聚焦显微镜观察γH2AX/53BP1共定位来评估DNA双链断裂（DSB）修复情况。此外，研究还通过siRNA敲低UPCI:SCC040细胞中的CXCR2表达，以验证其在治疗抵抗中的功能作用。
结果
- 1.
ABT-263在HPV阴性细胞中诱导凋亡性细胞死亡：Western Blot和Annexin V实验表明，ABT-263通过抑制抗凋亡蛋白Bcl-xL、激活促凋亡蛋白Bax并促进Caspase 9的剪切，有效诱导了两种细胞系的凋亡。联合放射治疗后，凋亡和坏死水平进一步升高，显示出协同效应。
- 2.
ABT-263减少放射诱导的衰老：形态学观察和SA-β-gal活性检测显示，放射处理显著增加了衰老细胞的比例，而ABT-263处理能够剂量依赖性地减少这一衰老细胞群。同时，衰老标志物Lamin B1的表达在照射后降低，ABT-263处理使其进一步减少。
- 3.
ABT-263对Cal33细胞具有放射增敏作用，但对UPCI:SCC040细胞无效：细胞活力实验和克隆形成实验结果显示，在Cal33细胞中，即便是低浓度的ABT-263（1 μM）与放疗联合，也能显著降低细胞活力和克隆形成能力，表现出强大的放射增敏效果。然而，在UPCI:SCC040细胞中，ABT-263单药在较高浓度（≥5 μM）下能降低细胞活力，但与放疗联合并未显著影响其克隆形成存活率，即未观察到放射增敏作用。
- 4.
ABT-263改变SASP因子的基因表达和分泌：研究人员检测了多种SASP相关因子。有趣的是，尽管两种细胞系对多种因子的调节模式相似，但在CXCR2受体的表达上存在显著差异。在Cal33细胞中，放疗和ABT-263处理均下调了CXCR2的表达。相反，在UPCI:SCC040细胞中，放疗和ABT-263处理均诱导了CXCR2表达的上调。
- 5.
抑制CXCR2信号可触发UPCI:SCC040细胞中ABT-263诱导的放射增敏：为了验证CXCR2的作用，研究人员使用siRNA敲低了UPCI:SCC040细胞中的CXCR2。结果显示，单纯的CXCR2敲低并不影响细胞的放射敏感性。然而，当CXCR2被敲低后，再联合使用ABT-263和放疗，则能显著降低UPCI:SCC040细胞的克隆形成存活率，实现了与Cal33细胞类似的放射增敏效果。
- 6.
ABT-263的放射增敏作用并非由DNA损伤增加引起：通过检测放射后24小时的残留DNA损伤灶（γH2AX/53BP1共定位），发现无论是在Cal33细胞还是在CXCR2敲低或未敲低的UPCI:SCC040细胞中，ABT-263处理均未显著增加残留的DNA损伤。这表明放射增敏效应主要源于对凋亡和细胞存活信号的调控，而非影响DNA损伤修复能力。
讨论
本研究证实，靶向衰老细胞的抗凋亡通路（使用ABT-263）能够有效清除放射诱导的衰老细胞并促进凋亡，从而在某些HNSCC细胞中实现放射增敏。然而，治疗效果存在细胞系特异性差异，这种差异与CXCR2的表达调控方向密切相关。在CXCR2表达下调的Cal33细胞中，ABT-263单独即可实现增敏；而在CXCR2表达上调的UPCI:SCC040细胞中，需要同时抑制CXCR2信号才能克服抵抗。CXCR2是一个G蛋白偶联受体，其配体包括IL-8、CXCL1等SASP因子，能激活MAPK、NF-κB等促生存和增殖信号通路。研究结果表明，CXCR2介导的信号是HNSCC细胞获得放射抵抗的关键机制之一。这一发现与之前关于SASP和CXCR2在放疗抵抗中作用的研究相一致。此外，CXCR2在肿瘤微环境中还参与招募免疫抑制性细胞（如中性粒细胞），提示靶向CXCR2可能具有重塑肿瘤免疫微环境的潜力。研究局限性在于仅使用了两个细胞系模型，未来需要在更多具有高衰老和SASP特征的HNSCC模型中进行验证。
结论
放射治疗诱导的细胞衰老是HNSCC放疗抵抗的重要机制。使用ABT-263等senolytic药物清除衰老细胞，是一种有前景的放射增敏策略。本研究发现，该策略的成败高度依赖于CXCR2介导的信号通路：当CXCR2表达被抑制或下调时，ABT-263能有效发挥放射增敏作用；而当CXCR2表达上调时，则会削弱ABT-263的疗效，此时需要联合靶向CXCR2才能克服抵抗。因此，CXCR2表达水平可能作为预测ABT-263联合放疗疗效的生物标志物，同时CXCR2本身也是一个潜在的可成药靶点，为开发针对难治性HPV阴性HNSCC的联合治疗新方案提供了理论依据。
