《Retrovirology》：Versatile HIV Rev-dependent reporter cell system for stringent and sensitive quantification of viral reservoirs, neutralizing antibodies, and restriction factors
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这篇综述系统阐述了一种新型Rev依赖型HIV报告细胞系统的开发与应用。该系统通过在HIV长末端重复序列（LTR）驱动的转录基础上，引入Rev反应元件（RRE）和剪接调控，实现了对Tat和Rev蛋白的双重依赖，从而显著降低了由有丝分裂原等因素引起的非特异性背景信号。作者验证了多种源自不同T淋巴细胞和贴壁细胞系的报告细胞株（如Molt4-CCR5, SupT1-CCR5, CEM-SS, A3R5, TZM平台）的性能，证实其对X4和R5嗜性病毒均具有响应性。该系统凭借其高灵敏度和特异性，在病毒储存库定量病毒生长试验（VOA）、中和抗体检测、限制因子筛选以及抗病毒化合物测试等多种应用场景中展现出巨大潜力，为HIV治疗和疫苗研究提供了一个强有力的多功能工具平台。
开发多种适用于HIV研究不同应用的Rev依赖型报告细胞
在HIV研究领域，开发灵敏且特异的报告细胞系统对于常规定量病毒滴度、复制动力学、感染抑制以及表征患者病毒储存库至关重要。传统的报告系统主要依赖HIV长末端重复序列（LTR）来驱动报告基因表达，通过HIV Tat蛋白的反式激活来上调。然而，LTR容易受到有丝分裂原、细胞因子或其他刺激物的Tat非依赖性诱导，这种“泄露”表达会干扰终点判断，阻碍报告系统在高灵敏度应用（如病毒生长试验VOA）或存在LTR调节化合物（如血浆中的中和抗体或小分子抑制剂）的情况下的使用。
为了应对这一挑战，研究人员此前开发了Rev依赖型HIV报告载体技术。这些系统保留了病毒LTR及其部分Tat依赖性，但增加了由HIV Rev介导的转录后调控层。在Rev依赖型载体中，报告基因cDNA与Rev反应元件（RRE）并列，并置于病毒剪接供体（D4）和剪接受体（A7）之间。在缺乏Rev蛋白的情况下，未剪接的转录本被保留在细胞核内直至剪接完成，从而消除了报告mRNA。在感染期间，来自HIV原病毒转录的细胞内Rev与未剪接的报告转录本结合，促进其核质输出，上调表达。这种对细胞内Tat和Rev的双重需求显著提高了报告基因表达的特异性。降低的HIV非依赖性背景报告表达使这些系统特别适用于需要高特异性和高灵敏度的应用。
本文报告了源自T淋巴母细胞系（MOLT-4-R5、SupT1-R5、A3R5）以及基于HeLa克隆JC53的TZM平台的新型Rev依赖型报告细胞的开发。这些细胞表达CD4、CXCR4和不同水平的CCR5。研究人员比较了这些细胞系对X4和R5嗜性病毒（NL4-3和JR-CSF）的响应性，并证实这些细胞中的报告基因表达不受有丝分裂原刺激的影响，但对HIV Tat和Rev有响应，从而减少了来自泄漏LTR启动子的非特异性报告诱导。为了验证Rev依赖型报告细胞系统的灵敏度，研究人员使用来自马拉维一名成人的三种原发性HIV-1 C亚型病毒群进行了病毒稀释试验。此外，还验证了这些系统在定量抗体中和以及筛选限制因子方面的适用性；这些系统对于临床和基础研究中量化病毒储存库的病毒生长试验（VOA）也具有高灵敏度。
报告基因特异性及对HIV Tat和Rev依赖性的验证
研究人员进一步验证了Rev依赖型报告细胞中Tat和Rev的必要性，以Rev-CEM细胞为例。用野生型HIV-1或Rev突变体HIV-1 (RS4X)感染Rev-CEM细胞。从HIV-1基因组中删除Rev基因会降低感染细胞中的GFP报告基因表达，表明在HIV-1 (RS4X)感染期间表达的其他病毒蛋白不足以诱导可检测的报告基因表达。相反，在感染整合酶突变体HIV-1 (D116N)后，检测到低水平的GFP表达。已知某些HIV-1整合酶突变体可以介导病毒早期蛋白（如Tat、Rev和Nef）的低水平表达。研究人员还构建了一个仅表达Tat和Rev的慢病毒载体pLenti-Tat/Rev-Neo，并用其产生的慢病毒颗粒感染Rev-A3R5-GFP细胞。结果显示，Tat和Rev的表达足以介导Rev-A3R5-GFP中GFP报告基因的表达。这些发现也与之前的研究一致，该研究表明细胞内（而非细胞外）Tat足以诱导转染了Rev的TZM-GFP细胞中的报告基因表达。
考虑到报告基因开启所需的最低Tat和Rev要求，研究人员探究了其他T细胞激活剂如PHA加IL-2是否能非特异性地激活Rev依赖型细胞。同时用PHA和IL-2处理细胞可作为激活刺激，诱导细胞增殖以及转录因子和HIV LTR的激活。作为比较，研究人员还测试了PHA加IL-2对Tat依赖型、LTR驱动的荧光素酶报告细胞1G5的刺激。在相同条件下，用PHA加IL-2刺激Rev依赖型T细胞Rev-CEM-Luc和1G5，并在12、24和48小时收集荧光读数。1G5细胞在各时间点与未处理细胞相比，荧光素酶报告基因响应显著增加了2-4倍，而Rev-CEM-Luc则表现出最小的响应，与未处理的对照细胞相似。同样，之前的工作比较了另一种Rev依赖型GFP指示细胞Rev-CEM与Tat依赖型报告细胞系CEM-GFP的报告基因诱导情况。与目前的研究结果一致，PMA诱导（100 ng/ml）在Tat依赖型CEM-GFP细胞中引起HIV非依赖性的GFP平均荧光强度增加四十倍，而Rev-CEM细胞系则无响应。此外，据报道，其他细胞因子包括TNF和GM-CSF在缺乏HIV感染的情况下也无法诱导Rev-CEM细胞中的GFP表达。这些结果共同证明了本文描述的Rev依赖型指示细胞具有高严格性，并且报告基因的诱导需要Tat和Rev两者。
阐明MoltR5-GGR用于单HIV感染细胞的高度灵敏定量病毒生长试验（QVOA）
体内HIV表型多样性的重要性仍未完全明了。同样，体内病毒适应性和细胞宿主范围的决定因素与体外病毒生长试验（VOA）中的表现相关性也较差。因此，需要一个强大的细胞平台来研究病毒准种的表型及其对体内病毒致病性或持久性的潜在影响。先前，研究人员开发了Sup-GGR细胞用于淋巴细胞病毒生长试验。在本文介绍的更新的Rev依赖型报告细胞变体中，发现一种T细胞系MoltR5-GGR对R5和X4嗜性病毒产生的信号分别比Sup-GGR高约4倍和6倍。这种增强的灵敏度表明，MoltR5-GGR在极限稀释定量病毒生长试验（QVOA）中可能具有高性能。
研究人员进一步探索了MoltR5-GGR在此背景下的应用，使用了携带三种病毒群之一的HIV阳性输入细胞（SupR5-mCherry）。这些病毒群先前是从一名病毒血症马拉维成年人的肺泡巨噬细胞或外周血单个核细胞（PBMC）中培养分离得到的。感染了mCherry的SupR5细胞通过流式细胞分选（FACS）收集，并以单细胞密度与MoltR5-GGR共培养。在共培养的第4天和第7天纵向收集培养上清液，并使用高斯荧光素酶（GLuc）测定法定量复制情况。
在实验过程中，特别是从共培养后第4天到第7天，GLuc阳性孔的比例在27Z-M（从5.5%升至16.7%）和27Z-P生长板（从7.4%升至11.1%）中均有所上升。GLuc测定表明，阳性孔（通过Tukey统计分析定义为>1.5倍四分位距的离群值）在测定第4天到第7天期间，其平均GLuc诱导有所增加。GLuc诱导是相对于每个板上MoltR5-GGR未感染孔的第25百分位数计算的。该系统能够分析每个病毒群中产生强烈诱导的遗传变异，无论是通过快速感染动力学、调节的细胞病变效应，还是Tat/Rev依赖性基因表达的变化。重要的是，这些结果是通过随时间对同一孔中的培养物进行纵向采样实现的。在试验结束时，可以收获含有感兴趣病毒变体的活细胞孔，用于扩增、测序和进一步表型分析。这些发现凸显了基于MoltR5-GGR和其他Rev依赖型报告细胞的QVOA测定法在生长早期从单个感染细胞中检测和表征病毒的潜力。
阐明Rev-A3R5-GFP和Rev-CEM-Luc用于筛选和定量中和抗体
A3R5淋巴细胞T细胞系是基于人CD4+/CXCR4+/α4β7+T淋巴母细胞样细胞系A3.01开发的。A3R5细胞表达CD4、CXCR4和CCR5，其CCR5表面表达水平明显低于TZM-bl细胞，但与刺激后的PBMC水平相似。该细胞系易受多种CXCR4和CCR5嗜性HIV-1流行株的感染。值得注意的是，由多种单克隆抗体和HIV+血清介导的中和作用在A3R5细胞中比在TZM-bl细胞中表现出一致更高的效力。A3R5特别适用于检测针对HIV-1第2层病毒株的弱中和抗体反应，并已在良好临床实验室规范（GCLP）条件下进行了广泛的优化和验证。经验证的A3R5测定法已被用于评估疫苗引发的中和抗体，并在全球疫苗试验中确定保护相关性。
研究人员利用A3R5的这些独特特性，将Rev依赖型GFP报告基因（pNL-GFP-RRE-SA-puro）嵌入A3R5，建立了Rev-A3R5-GFP报告细胞系。该细胞系特别适用于直接定量针对复制能力HIV-1（无论是实验室适应株还是原发性毒株）的抗体中和作用。作为概念验证，研究人员使用HIV-1(NL4-3)感染Rev-A3R5-GFP进行了中和抗体筛选。在感染前，将HIV-1病毒库与筛选板中的单个抗Env抗体一起孵育或不孵育。中和1小时后，用抗体-HIV-1混合物感染Rev-A3R5-GFP细胞2小时，然后洗涤，培养两天后进行流式细胞术分析。结果表明，最强的中和抗体是IgG1 b12、VRC03、5F7、17b、654、30D、F425、A1g8和HJ16，而其余抗体表现出弱到无中和活性。VRC03的IC50值被定量为1 μg/ml。
研究人员在另一个Rev依赖型细胞系Rev-CEM-Luc中，使用选定的中和HIV-1(NL4-3)抗体重复了此筛选。在测试的抗体中，654-30D、2G12、F105和17b表现出强烈的病毒感染抑制作用。在之前的研究中，抗体2G12对HIV-1(NL4-3)的IC50测定值为0.98 ± 0.42 μg/ml，而在本测定中计算出的IC50为0.94 μg/ml。这说明了Rev-CEM-Luc细胞能够可重复地定量中和抗体，与使用全长、具有复制能力的病毒的现有文献结果一致。
阐明Rev-A3R5-GFP用于定量HIV限制因子的效力
当整合到病毒颗粒中时，HIV限制因子如PSGL-1、APOBEC3G（A3G）和SERINC5会降低病毒感染性。病毒感染性的抑制通常是剂量依赖性的，并且可以使用指示细胞进行定量。研究人员使用Rev-A3R5-GFP来精确衡量这些限制因子的效力。使用Rev依赖型细胞的一个显著优点是，报告基因的表达或抑制是根据感染性病毒颗粒在靶报告细胞中表达Tat和Rev的能力进行精细调控的。相反，非感染性颗粒和病毒制备物中的细胞游离病毒蛋白（如细胞外Tat或Env）无法激活报告基因。这为在低浓度限制因子下超灵敏地检测病毒颗粒失活提供了关键优势。
以PSGL-1为例，Rev-A3R5-GFP能够在低至0.5–1.5 ng的PSGL-1浓度下检测到病毒颗粒的限制。PSGL-1的剂量依赖性抑制使研究人员能够确定在此特定定量中其IC50为3.64 ng。研究人员还比较了APOBEC3G和SERINC5的抗HIV-1活性，确定SERINC5对野生型HIV表现出较低的IC50为4.63 ng，其效力与PSGL-1相似，而APOBEC3G对HIV-1(NL4-3)表现出更高的IC50为380.52 ng。这些发现与先前的研究一致，即APOBEC3G对缺乏Vif的病毒更有效，但在存在Vif的情况下对野生型HIV-1效果较差。
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讨论
本研究展示了多种Rev依赖型报告细胞系的实用性。第一个此类报告系统由Wu等人开发；最近，Gludish和Salasc等人通过开发几种CXCR4和CCR5双表达细胞系中的新报告细胞扩展了该系统。本文还首次表征了源自MoltR5、CEM-SS和A3R5的Rev依赖型报告细胞。在这些系统中，除了细胞内Tat对LTR的部分依赖性转录调控外，还有一个额外的转录后调控层，由细胞内Rev与RRE的结合介导，从而实现了未剪接、包含报告基因ORF的转录本的核输出。通过对Tat和Rev的双重组合需求，报告基因的表达对包括有丝分裂原在内的外部刺激源无响应：这在Rev-CEM-Luc中得到了证明，其中添加PHA和IL-2可在LTR驱动的荧光素酶报告细胞系及其Jurkat衍生株1G5中诱导报告基因表达，但不会在Rev-CEM-Luc中诱导。这些发现的普遍性在一定程度上取决于IL-2受体的表达和功能——这可能因细胞系和克隆而异。然而，之前的工作显示，在PMA诱导后，Tat依赖型和Tat/Rev依赖型细胞系之间存在显著差异，这不能仅用IL-2R的可变表达来解释，因为PMA与该受体并不直接相互作用。相反，大量先前的研究表明，T细胞细胞因子或有丝分裂原刺激可以在没有Tat的情况下直接上调LTR启动子。据推测，在高水平内源性转录反式激活因子（如NF-κB、NFAT、SP-1和AP-1）驱动Tat非依赖性转录的情况下，Rev依赖型报告系统会产生包含报告基因ORF的全长转录本，但这些转录本通过既定机制被隔离在细胞核内，阻止了表达。在生理环境下，对细胞内Rev的需求似乎是近乎绝对的；然而，Gludish等人表明，超生理水平的细胞内Tat可以诱导低水平的报告基因表达。在这些情况下，核滞留机制可能会不堪重负，导致未剪接转录本泄漏，这些转录本在细胞质中足够稳定和持久，从而能够进行翻译。有趣的是，在细胞外Tat中未观察到这种效应，这可能意味着细胞进入、核定位或获得特定翻译后修饰的效率不足，可能阻碍了充分的反式激活。然而，研究人员也证明，在正常感染条件下，Rev非依赖性的报告基因表达不太可能发生，因为源自NL4-3的ΔRev突变体未能诱导报告基因表达。
此外，研究人员确定了Rev依赖型细胞系对X4和R5嗜性病毒NL4-3和JR-CSF的允许性和响应性。虽然所有细胞系都表现出HIV驱动的报告基因表达，但观察到了相当大的变异性。这很可能归因于本工作未探索的克隆特异性因素。可能导致可变响应性的驱动因素包括辅助受体和限制因子的表达，而整合位点位置和拷贝数可能影响灵敏度，这些因素以及其他因素的组合影响了在更高病毒滴度存在下的最大报告基因表达。Rev-CEM-Luc和Rev-CEM对R5嗜性HIV-1的低水平响应表明CCR5表达极低：虽然CEM细胞通常表达检测不到或可忽略不计的CCR5水平，但在KLF2存在下可以诱导表达，并且推测类似效应驱动了这些克隆中的最低限度表达。在所测定的报告细胞系中，SupR5-GFP和Rev-A3R5-GFP分别对JR-CSF和NL4-3表现出最高的响应，表明上述因素的独特组合导致了更高的响应性。此外，所有肿瘤细胞系共有的染色体不稳定性使得细胞克隆在培养过程中容易随着时间推移产生遗传和转录异质性。需要强调的是，本文介绍的几种Rev依赖型细胞变体可能适用于多种定量感染性HIV的测定，但应根据计划测定的相关参数对细胞进行经验性确定。
Rev依赖型报告系统的灵敏度在MoltR5-GGR细胞中得到了具体验证，该细胞表达hrGFP和分泌型高斯荧光素酶（GLuc），使用的是一种来自未表征病毒群的原发性HIV-1 C亚型分离株27Z-P。通过病毒稀释试验，证明了两种报告基因对细胞游离病毒的高水平灵敏度，其中荧光素酶终点更为灵敏。此外，分泌型荧光素酶提供的便捷纵向采样能力允许在后期时间点进行更灵敏的检测。然而，MoltR5-GGR系统旨在测量共培养系统中的感染，如在VOA中。因此，为了确定在此应用（单个细胞介导感染）中的功能性，将MoltR5-GGR细胞暴露于每个孔单个感染的SupR5-mCherry细胞。报告阳性孔（GFP荧光和GLuc发光）的发展使得能够灵活地探究从人类患者分离的病毒群中单个克隆的表型和相关病毒基因型。在这里，研究人员比较了来自马拉维布兰太尔一名病毒血症成年人支气管肺泡灌洗液和外周血的生长培养物中的毒株。MoltR5-GGR的这一独特应用场景使得能够在实验室适应之前分析原发性分离株，从而能够鉴定原位HIV基因型，包括可能在培养过程中丢失的独特env序列：这些基因型的表征可以建立新的进化权衡、宿主因子依赖性和相互作用，这些可能在体外是多余的。
最后，研究人员探索了Rev依赖型系统在另一个重要应用中的功能性，即中和抗体和宿主限制因子的鉴定和筛选。使用Rev-A3R5-GFP和Rev-CEM-Luc，分别观察到抗体VRC03和2G12的剂量依赖性中和作用：在两种情况下，观察到的IC50与Huskens等人报告的数值以及商业VRC03供应商的数据一致。最后，在Rev-A3R5-GFP中证明了宿主限制因子对病毒复制的抑制，其中PSGL-1、APOBEC3G和SERINC5在转染到生产细胞后剂量依赖性地抑制报告基因表达。这是证明宿主限制因子抗病毒活性的广泛应用方法，但其解释可能受到转染基因非生理水平的限制。然而，这一局限在一定程度上通过病毒辅助蛋白（如Vif、Vpu、Vpr、Nef）的拮抗作用得以缓解，因为在各种靶细胞中，许多限制因子在生理水平上无法完全阻断病毒复制。宿主因子对HIV的限制也常常是剂量依赖性的，这因体外细胞谱系和体内不同靶细胞而异。因此，需要与靶细胞中这些因子的自然水平进行比较，以定量限制因子的相对抗病毒活性。这已使用Tat依赖型报告细胞（如TZM-bl）实现了半定量，但固有的LTR泄漏性使得准确量化限制因子活性变得困难，尤其是在低表达水平时。Rev依赖型报告细胞能够灵敏地检测低水平病毒整合限制因子和中和抗体对感染的抑制，突显了这些系统在筛选和表征中的实用性。此外，虽然本文未探讨，但研究人员之前已使用Rev-CEM-Luc展示了小分子抗病毒筛选。
总而言之，本文提供的数据确立了Rev依赖型报告细胞系统的灵敏度、特异性和便利性，同时引入了多种新的Rev依赖型报告细胞系。这些报告细胞系构成了HIV研究的多功能工具包，可轻松应用于多种HIV感染性测定：预计测定或研究者的目标将决定细胞系的选择。虽然当前工作未检查所开发的每种细胞类型在所有报告测定中的性能，但对细胞内Tat和Rev的双重要求使这些系统具有独特的能力，能够评估复杂基质（可能含有有丝分裂原或其他转录调节成分）中真正的病毒复制及其抑制。Rev依赖型报告细胞还允许探究可能仅短暂存在于原发性分离株中的新型基因型。最后，这些系统在中和抗体、限制因子和抗病毒药物的筛选和表征方面功能强大。考虑到这些特性，这些报告细胞系的开发和传播对HIV研究具有广泛的重要意义。
