《Orphanet Journal of Rare Diseases》：Gastrodin inhibits the formation of ataxin-3 aggregates by regulating the level of ERK1/2/P38 proteins
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本文首次揭示天然产物天麻素（Gastrodin）在脊髓小脑共济失调3型（SCA3/MJD）细胞模型中的治疗潜力。研究发现，天麻素能有效抑制致病性多聚谷氨酰胺（polyQ）扩展ataxin-3蛋白聚集，其作用核心机制在于选择性下调MAPK通路中的ERK1/2和p38蛋白，为开发靶向ERK1/2-p38信号轴的SCA3疾病修饰疗法提供了全新实验依据。
背景与目的
脊髓小脑共济失调3型（Spinocerebellar ataxia type 3， SCA3），又称马查多-约瑟夫病（Machado-Joseph disease， MJD），是一种目前无法治愈的常染色体显性遗传神经退行性疾病。该病的根本病因在于ataxin-3蛋白编码区的多聚谷氨酰胺（polyglutamine， polyQ）异常扩展，导致蛋白错误折叠并形成具有细胞毒性的不溶性聚集体，这是所有polyQ疾病的共同标志。SCA3的发病机制涉及蛋白毒性（proteotoxicity）与氧化应激之间的协同作用，形成恶性循环。目前尚无能够延缓疾病进展的疗法，因此，针对其致病机制开发新型治疗策略迫在眉睫。天麻素是中药天麻（Gastrodia elata Blume）的主要活性成分，已被证实具有抗氧化、神经保护等多种药理活性，并在阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病的模型中展现出抗蛋白聚集的潜力，但其在SCA3中的作用从未被评估。本研究旨在填补这一空白，探究天麻素在SCA3细胞模型中对ataxin-3蛋白聚集的影响及其分子机制。
研究方法
本研究采用了三种不同的细胞模型来系统评估天麻素的作用：亲本HEK293T细胞、表达生理长度ataxin-3-15Q的细胞以及表达致病性扩展ataxin-3-77Q的细胞模型。通过CCK-8法和MTT法评估了天麻素（浓度范围5 μM至100 μM）在不同时间点的细胞毒性。为了定量评估天麻素对蛋白聚集的影响，研究采用了滤膜捕获法（filter trap assay）来检测SDS不溶性聚集体，并通过细胞蛋白分级分离技术分析了不同溶解性蛋白组分（如Triton X-100可溶、SDS可溶及甲酸可溶组分）的变化。此外，还通过蛋白质免疫印迹检测了可溶性ataxin-3的蛋白水平。
在机制探索方面，研究首先通过总抗氧化能力（T-AOC）检测评估了天麻素在不同细胞模型中的抗氧化活性。随后，使用人类磷酸化激酶阵列芯片（Proteome Profiler Human Phospho-Kinase Array）对37种激酶进行了全景式分析，以识别受天麻素调控的关键信号节点。最后，通过蛋白质免疫印迹对MAPK通路的关键组分（如ERK1/2、p38及其上游的AKT、下游的p65等）的表达和磷酸化水平进行了验证。为了确证关键通路的作用，研究还使用了ERK抑制剂（Temuterikib）和AKT抑制剂（MK-2206）进行了功能挽救实验。
主要结果
- 1.
细胞安全性：在浓度为5-100 μM、处理时间从2小时到48小时的条件下，天麻素对表达ataxin-3-77Q的HEK293T细胞未表现出任何细胞毒性，表明其在研究剂量范围内安全。
- 2.
抑制蛋白聚集：与DMSO对照组相比，50 μM天麻素处理能显著减少由扩展ataxin-3形成的不溶性聚集体（p<0.01）。细胞分级分析进一步显示，天麻素处理减少了甲酸可溶（FA-soluble，即大的不溶性包涵体）组分的ataxin-3，同时增加了Triton X-100可溶（可溶性蛋白）和SDS可溶（小聚集体）组分的ataxin-3，提示天麻素可能促进大聚集体的解离或转化为更可溶的形式。蛋白质免疫印迹结果也证实，天麻素（10 μM或50 μM）处理4-24小时，能显著增加致病性ataxin-3-77Q的可溶性蛋白水平。
- 3.
抗氧化活性：在HEK293T细胞和表达ataxin-3-15Q的细胞中，天麻素处理增强了细胞的总抗氧化能力。然而，在表达致病性ataxin-3-77Q的细胞中，天麻素并未表现出显著的抗氧化活性，提示其保护作用可能还涉及抗氧化以外的其他信号通路。
- 4.
关键信号通路筛选：通过磷酸化激酶阵列分析，在表达ataxin-3-77Q的细胞中鉴定出10个在天麻素处理后表达发生差异的磷酸化蛋白。这些蛋白包括p38α（T180/Y182）、ERK1/2（T202/Y204， T185/Y187）、eNOS（S1177）、Src家族激酶等。其中，p38和ERK1/2构成了这个蛋白网络的核心枢纽。
- 5.
ERK1/2-p38轴的调控：蛋白质免疫印迹验证发现，天麻素处理能显著下调MAPK通路中ERK1/2蛋白的总水平及磷酸化水平，同时降低p38蛋白的总水平，但对其磷酸化水平影响不显著。上游激酶AKT的总蛋白水平有升高趋势，但其磷酸化水平未变。下游蛋白p65的水平在表达ataxin-3-15Q的细胞中被天麻素显著提高。
- 6.
ERK通路的功能确证：在使用更高聚合度ataxin-3-148Q模型的实验中，天麻素能显著抑制蛋白聚集。然而，当同时使用ERK通路抑制剂时，天麻素的抗聚集作用被完全取消；而使用AKT抑制剂则不影响天麻素的功效。这直接证明天麻素的神经保护作用特异性依赖于ERK信号轴。
讨论与结论
本研究首次提供了天麻素能够减轻SCA3细胞模型中polyQ介导的蛋白毒性的证据。其核心机制在于，天麻素通过抑制ERK1/2-p38信号轴来减少ataxin-3的聚集。值得注意的是，天麻素不仅降低了ERK1/2的磷酸化激活状态，更独特地降低了其总蛋白水平，这暗示了一种可能涉及蛋白稳定性调控的双重作用模式。
讨论部分进一步阐述了该发现的深远意义。在SCA3的发病过程中，ERK和p38作为MAPK家族成员，是氧化应激和蛋白稳态破坏信号的汇聚点。天麻素对ERK1/2-p38轴的协同抑制，精准地干预了疾病进展的关键环节。ERK的过度激活在多种神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症）中被证实与病理蛋白聚集相关，抑制ERK通路已被证明能减轻毒性。同样，p38α的激活参与炎症、自噬和凋亡过程，抑制p38通路有助于清除蛋白聚集体。本研究中，天麻素对总p38蛋白水平的降低，可能有助于抑制应激诱导的凋亡。
此外，研究观察到在致病性ataxin-3存在下，炎症关键转录因子p65（NF-κB）的基础水平降低，且对天麻素的反应受损，这提示polyQ扩展可能损害了细胞的炎症反应能力，这一现象值得进一步探究。
综上所述，本研究揭示了天麻素通过调控ERK1/2/p38通路抑制致病性ataxin-3聚集的新机制，为将这种具有良好安全性和血脑屏障通透性的天然产物开发为SCA3的疾病修饰疗法奠定了重要的临床前基础，也为针对MAPK信号通路的神经退行性疾病治疗策略提供了新的思路。未来的研究需要在患者来源的神经元和SCA3动物模型中进行验证，并深入阐明天麻素降低ERK总蛋白水平的具体分子机制。
