《Journal of Animal Science and Biotechnology》：Advancing immunity and disease resistance in chickens through genome editing
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这篇综述系统总结了CRISPR/Cas9等技术在鸡基因组编辑领域的最新成就，聚焦于通过遗传操作提升其免疫力和抗病性。文章回顾了构建基因敲除（KO）和转基因鸡模型的研究进展，例如敲除RAG1、干扰素受体（IFNAR/IFNLR）以及T细胞亚群的模型，并探讨了针对禽流感病毒（AIV）通过编辑酸性核磷蛋白（ANP32）家族获得抗性、以及在鸡中重新引入视黄酸诱导基因I（RIG-I）及其泛素化因子环指蛋白135（RNF135）等关键工作。这些研究不仅加深了对禽类宿主-病原体相互作用的理解，也为培育抗病家禽品种、应对禽流感等重大威胁提供了新的生物技术策略和潜在解决方案。
基本研究：体外方法的运用
体外模型为研究鸡的免疫系统提供了宝贵数据。例如，研究者利用鸡输卵管原代细胞评估了新型重组启动子驱动转基因表达的效率，这在未来构建转基因鸡品系方面具有应用前景。在DF-1（一种自发永生化鸡成纤维细胞系）细胞中进行的研究证实了CRISPR激活（CRISPRa）或抑制（CRISPRi）系统在转录研究中的有效性。此外，通过敲低和过表达受体相互作用蛋白激酶2（RIPK2），对HD11（来源于鸡骨髓的巨噬细胞系）细胞的转录组分析揭示了其参与细胞外基质（ECM）-受体相互作用、粘着斑以及转化生长因子（TGF）-β信号通路等分子事件。
研究还表明，用益生菌（如枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌）处理鸡的外周血单个核细胞（PBMCs）具有免疫调节作用，表现为白细胞介素-10（IL-10）和（C-C基序）配体5（CCL5）表达的增加。近期研究在鸭胚细胞中发现了鸟类中先前被认为不存在的干扰素调节因子3（IRF3）和干扰素调节因子9（IRF9），并证明它们对鸭细胞中干扰素介导的反应及后续的干扰素刺激基因（ISGs）诱导至关重要。在DF-1细胞中过表达哺乳动物的粘病毒抗性（Mx）基因能显著降低禽流感病毒的复制。值得注意的是，DF-1细胞由于高表达细胞因子信号传导抑制因子1（SOCS1），其先天免疫反应相较于鸡胚原代成纤维细胞（CEFs）有所减弱，因此在解读先天免疫相关数据时需要谨慎。
通过比较病理学获得对宿主-病原体相互作用的新见解
比较研究有助于理解水禽与家禽之间的差异，从而改善对宿主-病原体相互作用的认识。例如，比较鸭和鸡的血管内皮细胞感染高致病性禽流感病毒（HPAIV）H5N1后的先天免疫反应发现，鸡的内皮细胞在引发鸡（而非鸭）的促炎细胞因子风暴中发挥作用。感染HPAIV H5N6后，鸭的内皮细胞感染程度也低于鸡。研究还表明，H5N1能在鸭体内诱导强烈的细胞免疫反应，感染后7-9天CD8+T细胞数量显著上调。对H5N6禽流感病毒两种不同基因型的比较发现，一组含有H9样PB2和PB1基因的病毒在哺乳动物细胞和小鼠中复制效率高，而另一组带有H3样PB1基因的病毒则偏好禽类细胞，且在水禽中传播性更强。此外，对鸽子、乌鸦、鸡和鸭等禽类物种感染H5N1的易感性进行跨物种比较，揭示了一系列差异调节基因。对鸭感染强毒或弱毒H5N1毒株后的差异蛋白质组分析发现，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路高度参与，该通路已知负责生长调节、细胞增殖和代谢。
通过转基因技术探索禽类免疫系统
鸡为理解不同的免疫学功能做出了重要贡献。CRISPR/Cas9的发现促进了新的基因工程鸡品系的产生，从而能详细解析免疫系统。这体现在一系列重要基因工程鸡的构建上，包括敲除RAG1、敲除干扰素α和λ受体（IFNAR和IFNLR）、以及缺失αβ或γδ T细胞或两者都缺失的品系。
研究人员通过磁激活细胞分选法分离胚胎第6天的雄性生殖腺，利用CRISPR/Cas9靶向RAG1的第一个外显子，并结合带有CMV启动子驱动的tdTomato报告基因的供体质粒，通过G418抗生素筛选，成功产生了RAG1敲除鸡。这些缺乏RAG1的鸡存在免疫缺陷，并表现出适应性免疫细胞发育的改变，包括胚胎期V(D)J重组中断、免疫球蛋白水平降低以及T和B细胞成熟受阻。后续研究利用RAG1 KO鸡鉴定出鸡体内存在两个自然杀伤（NK）细胞亚群（NK-1和NK-2），与人类和小鼠中的类似，揭示了跨物种进化保守的免疫机制。
研究还细致地阐明了αβ或γδ T细胞在鸡中的作用。利用同源定向修复（HDR）技术分别删除了γ或β链的恒定区。删除αβ T细胞导致了严重的免疫表型，表现为脾脏和腺胃出现肉芽肿和炎症，且γδ T细胞未能对此进行补偿。出乎意料的是，删除γδ T细胞并未导致明显的免疫表型，这说明了αβ T细胞在鸡免疫系统中的关键调节作用。最近的研究探讨了γδ T细胞在高毒力马立克氏病病毒（MDV）感染中的作用。缺乏γδ T细胞导致MDV在胸腺和脾脏中大量复制，并与病毒诱导的肿瘤高发生率相关，结论是鸡体内的γδ T细胞在MDV的致病机制中扮演着关键角色。
此外，缺乏Tetherin/BST2的鸡在感染原型禽逆转录病毒后，表现出比野生型（WT）鸡显著更高的病毒血症，这首次揭示了该基因在鸟类呼肠孤病毒致病机制中的作用。通过构建XCR1-iCaspase9-RFP鸡，可视化并消融了XCR1+常规树突状细胞（cDCs），揭示了关于鸡常规树突状细胞的新数据。研究表明，敲除趋化因子受体XCR1会阻止cDCs与CD8+T细胞的聚集。最近，I型和III型干扰素受体敲除鸡的产生揭示了关于禽类免疫系统的关键见解。研究发现I型干扰素调节先天免疫细胞群以及T细胞，并影响抗体产生。利用不同甲型流感病毒亚型进行的实验揭示了干扰素在病毒致病机理、免疫反应和组织嗜性效应中的重要作用。
从对感染具有抗性或低敏感性的物种中学习
从对传染性病原体敏感性较低或有抗性的鸟类物种中获取知识已被证明非常有益。例如，基于其他对禽白血病病毒J亚群（ALV-J）具有天然抗性的鸟类中发生的自然突变，利用CRISPR/Cas9系统在鸡的Na+/H+交换器1型（chNHE1）中特异性诱导单个氨基酸突变，这一遗传修饰影响了ALV-J的细胞附着，使鸡获得了对该病毒的抗性。这证明了基于自然突变、利用基因组编辑获得对病原体抗性的有效性。同样，针对感染细胞多肽-4（ICP4）等基因靶点，产生了转基因鸡，其MDV复制率显著低于野生型鸡。
禽流感病毒的病毒库是野生鸟类，特别是鸭子，尽管能有效复制病毒，但表现出的临床症状比鸡或其他鸡形目鸟类轻微。长期以来，人们认为鸭子能作为病毒库主要与其表达视黄酸诱导基因I（RIG-I）有关，而该基因在鸡和其他鸡形目鸟类中已进化丢失。在鸡中重新引入RIG-I及其泛素化因子RNF135，揭示了一系列生理和病理方面的发现。在未感染鸟类中，重新表达RIG-I导致了适应性免疫反应的改变。然而，用强毒流感毒株进行的体内攻毒实验却导致了高死亡率，这与有害的炎症反应相关。例如，感染H3N1的RIG-I表达鸡，其IL-1β、IL-6、IFN-α和IFN-γ的表达量显著高于其他感染鸡。这项研究还揭示，病毒库与禽流感之间独特的相互作用并非仅因RIG-I的存在，还可能与其他尚未识别的因素有关。例如，在鸭胚成纤维细胞中，鸭RIG-I与坦布苏病毒的相互作用研究表明，TRIM35会阻碍鸭TRIM25介导的鸭RIG-I泛素化，从而促进病毒复制。RIG-I与病毒的相互作用可能具有物种依赖性。先前研究表明，禽流感病毒的NS1蛋白能抑制人RIG-I的泛素化，但对鸭RIG-I则无此作用。
抗禽流感鸡：现状与局限
培育对禽流感病毒具有抗性或低敏感性的鸡面临着挑战，主要与难以找到合适的宿主因子以及病毒的高突变率有关。必须指出，任何针对禽流感抗性的培育都必须极其谨慎，因为存在适应性突变的风险。研究表明，甲型流感病毒每个复制基因组平均包含2-3个突变，这可能导致逃逸突变株的出现。
在培育抗禽流感鸡方面，一项基础性研究聚焦于酸性核磷蛋白，特别是酸性（富含亮氨酸）核磷蛋白32家族成员A（ANP32A）。Long等人描述了哺乳动物和鸡ANP32A序列的差异，以及富含亮氨酸重复序列和羧基末端低复杂度酸性区域结构域之间33个氨基酸的缺失如何影响禽病毒聚合酶的功能。这些观察结果为通过靶向ANP32基因家族培育抗禽流感感染的鸡奠定了基础，该家族支持病毒基因组在宿主细胞内的转录和复制。在低剂量H9N2病毒攻击下，大多数编辑鸡未被感染。然而，高剂量感染则导致突破性感染，使得病毒能够适应经过编辑的鸡ANP32A（通过引入N129I和D130N两个氨基酸取代产生）。此外，完全移除鸡ANP32A驱动病毒向其他酸性核磷蛋白（包括鸡ANP32B和ANP32E）适应。作者得出结论，实现完全免疫似乎具有挑战性，可能需要多基因的遗传修饰。Sheppard等人的研究证实了这些观察结果，他们报告称，仅在缺失ANP32A和ANP32B的人源细胞中传代两次后，禽流感病毒的复制即达到高水平。
未来在禽流感抗性领域的努力可能侧重于靶向参与病毒复制的鸡细胞因子。这可能包括Sec61，它负责流感病毒蛋白（如HA）的生物合成。这曾在哺乳动物细胞中进行过研究，部分敲除或化学抑制Sec61会选择性损害流感病毒以及HIV和登革热病毒的糖蛋白稳态。
结论与未来展望
自CRISPR/Cas9发现以来，以及得益于原始生殖细胞（PGCs）长期培养和遗传修饰技术的显著优势，家禽生物技术工具的研究空白正在被填补。这体现在一系列作为免疫学研究模型的基因工程鸟类的产生，以及为预防感染提供新解决方案的其他品系上。新的有前景的研究正在进行，旨在探索和建立来自不同物种（如鹅和鸽子）的PGC培养体系。家禽研究也应更多地将鸡作为比较病理学模型，这将增进我们对宿主-病原体相互作用的基本机制及相关进化机制的理解。
当前H5N1形势带来的持续健康风险，要求我们基于基因组编辑开发新的解决方案，以更好地理解宿主-病原体相互作用并预防感染。然而，必须考虑可能发生的适应性突变，并持续评估其致病潜力。实现这一目标可能需要多基因编辑以及新的递送和疫苗接种工具，包括使用病毒样颗粒（VLPs），以兼顾效率与生物安全性。
公众对消费基因修饰动物产品的看法很可能在未来数年里持续引发争论。但我们认为，这个问题应根据基因修饰本身进行个体化评估。以往的育种策略曾成功培育出对球虫病和马立克氏病具有抗性的品种。因此，基于从低敏感性物种收集的遗传信息，精心规划精准的基因组编辑，可能会提供强大的健康解决方案，正如先前原理验证性研究所展示的那样。
