《Artery Research》：Exploring Genetic Association Between Gut Microbiota and Thoracic Aortic Aneurysms
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本文运用孟德尔随机化（MR）方法，初步探索了肠道菌群与胸主动脉瘤（TAA）及其升/降主动脉直径变化之间的遗传关联。研究发现了一批具有名义相关性（pFDR> 0.05）的微生物类群，并构建了可视化网络以展示其复杂关联模式。这为理解微生物在TAA病理机制中的潜在角色提供了初步的、探索性的遗传学线索，提示未来研究可从菌群-宿主互作角度寻找新的生物标志物和干预靶点。
引言
胸主动脉瘤（TAA）是一种以主动脉直径增大≥50%为特征的血管疾病，主要累及主动脉根部及升主动脉（60%），降主动脉受累占40%。由于对其早期致病机制理解有限，亟需新的生物标志物以改善预防和治疗策略。人类肠道菌群主要由拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和放线菌门主导。作为一种代谢活跃的、类似内分泌的器官，肠道微生物组越来越多地被认为能够影响宿主生理功能。在自身免疫性大血管疾病中已观察到肠道菌群的改变，例如口腔细菌链球菌和弯曲杆菌的增多。一项涉及49名TAA患者的研究发现了微生物差异，包括肠杆菌科和普雷沃菌属。尽管这些发现提示了肠道菌群与TAA之间的关联，但这种关系的性质仍不确定，现有证据尚不能阐明这些关联是反映了潜在的遗传机制还是继发的炎症过程。理解肠道菌群与TAA之间的相关性对于推进TAA的诊断、治疗及患者康复研究至关重要。孟德尔随机化（MR）是一种利用遗传变异作为工具变量来探索暴露因素与结局之间因果关联的先进研究方法。通过利用配子形成时等位基因的随机分配，MR有助于减轻环境因素的混杂效应，并避免反向因果偏倚，因为基因型不受疾病影响。本研究采用两样本MR分析来探索肠道菌群与TAA之间潜在的遗传关联。鉴于当前微生物组GWAS数据集的探索性质，我们的目标是识别可能指导未来机制和流行病学研究的名义信号，而非建立确定的因果效应。
方法
研究设计
本研究的数据摘要来自于已发表的研究，所有数据均通过了机构审查委员会的批准。此次MR分析中从遗传变异中选择工具变量（IVs）严格遵守了MR的三项核心假设：1）作为选择的IVs，遗传变异与暴露因素显著相关；2）遗传变异与任何混杂因素无关；3）遗传变异只能通过暴露因素间接影响结局，而无其他途径。
数据来源与工具变量选择
TAA的GWAS数据：升主动脉和降主动脉直径的汇总数据来自英国生物银行。TAA的汇总数据来自FinnGen联盟的最新发布版本（第8版）。本研究共纳入了8,597例TAA病例和333,128例对照。
肠道菌群的GWAS数据：肠道菌群的GWAS数据来自《自然·遗传学》杂志的出版物。该GWAS数据包含211种肠道菌群类型，分为门、纲、目、科、属五个层级。
工具变量选择：本研究使用的IVs基于特定标准选取。首先，从GWAS数据中筛选出与肠道菌群强相关的单核苷酸多态性（SNPs）（p < 5 × 10?5）。其次，纳入次要等位基因频率（MAF）> 0.01的SNPs。第三，采用聚类过程（r2< 0.001， 聚类距离 = 10，000 kb）以减轻连锁不平衡的影响，确保SNPs之间的独立性。第四，将选定的SNPs与结局GWAS数据进行匹配，缺失的SNPs用高LD代理SNPs（r2> 0.8）替换。最后，去除回文SNPs后，剩余的SNPs被用作IVs。通过计算F值来评估每个IV的强度，公式为：F = R2× (N-2) / (1-R2)，F > 10表示工具变量强度足够。
孟德尔随机化分析
使用包括MR-Egger、加权中位数、加权众数和逆方差加权（IVW）在内的方法探究肠道菌群与TAA之间的潜在关系，其中IVW作为主要分析方法。IVW通过合并多项研究的结果来估计效应量，并计算比值比（ORs）和95%置信区间（CIs）。使用R 4.0.5版本进行两样本MR分析，数据可视化包括森林图、散点图和漏斗图。鉴于分析的探索性质，所有MR估计结果均需谨慎解读，特别是在不同MR方法得出不一致结果时。
核心关联网络可视化
为了展示肠道菌群与TAA之间MR衍生的关联模式，基于MR分析结果使用Python进行了可视化。首先，使用pandas库对MR分析数据进行预处理，筛选IVW方法的结果，并根据比值比（OR）和p值创建因果方向和显著性权重；接着，使用networkx库构建了一个有向网络图，其中节点代表微生物和表型，边代表因果关联，并通过力导向布局算法优化节点位置；最后，使用matplotlib库对网络图进行视觉编码，将节点颜色和形状映射到实体类型，将边的颜色和粗细映射到因果方向和显著性强度。使用错误发现率（FDR）校正方法对关联的p值进行多重检验校正，以pFDR< 0.05为统计学显著。
敏感性分析
敏感性分析对于检测潜在的基因多效性和评估IV异质性至关重要。Cochran’s Q统计量用于量化IV异质性，p值 > 0.05表示低异质性且对IVW结果影响最小。使用MR-Egger回归和MR-PRESSO方法评估IVs中潜在的水平多效性。MR-Egger回归可探索水平多效性，截距项接近零或不显著则提示其不存在。MR-PRESSO方法可检测潜在异常值（p < 0.05的SNPs），将其剔除以校正水平多效性。留一法敏感性分析用于识别并剔除对结果有显著影响的SNPs，以确保探索性发现具有更强的稳健性。
结果
工具变量选择
在评估肠道微生物对常见胃肠道疾病的因果效应时，根据筛选标准，我们共获得了1，503个与211种肠道微生物强相关的SNPs。SNPs的F统计量范围在17.17至87.3之间，平均值为23.11，表明工具变量强度足够。
肠道菌群对TAA的因果效应
本研究通过IVW分析发现了21个肠道菌群与主动脉直径风险之间的名义关联。IVW分析主要发现，草酸杆菌科（OR： 1.062， 95% CI： 1.002–1.126， p = 0.042）、未知属（OR： 1.059， 95% CI： 1.003–1.118， p = 0.038）和草酸杆菌属（OR： 1.051， 95% CI： 1.001–1.103， p = 0.047）与更高的TAA风险存在名义关联。相反，XI科（OR： 0.961， 95% CI： 0.925–0.999， p = 0.042）、黑色细菌纲（OR： 0.942， 95% CI： 0.889–0.998， p = 0.043）、δ-变形菌纲（OR： 0.901， 95% CI： 0.822–0.987， p = 0.025）、XIII UCG001属（OR： 0.888， 95% CI： 0.795–0.991， p = 0.034）和变形菌门（OR： 0.799， 95% CI： 0.710–0.898， p = 0.001）与更低的TAA风险存在名义关联。此外，毛螺菌科ND3007组（OR： 1.176， 95% CI： 1.022–1.353， p = 0.023）、梭状芽孢杆菌属（OR： 1.092， 95% CI： 1.008–1.183， p = 0.031）、艾格特菌属（OR： 1.067， 95% CI： 1.015–1.123， p = 0.012）和Tyzzerella3属（OR： 1.056， 95% CI： 1.017–1.096， p = 0.004）与更高的升主动脉直径（AAD）风险存在名义关联。相反，蓝细菌门（OR： 0.946， 95% CI： 0.900–0.994， p = 0.028）、甲烷短杆菌属（OR： 0.941， 95% CI： 0.886–0.999， p = 0.045）、毛螺菌科NK4A136组（OR： 0.930， 95% CI： 0.879–0.983， p = 0.011）和梭菌科1（OR： 0.874， 95% CI： 0.786–0.971， p = 0.012）与更低的AAD风险存在名义关联。进一步地，肠杆菌目（OR： 1.345， 95% CI： 1.003–1.803， p = 0.047）、肠杆菌科（OR： 1.345， 95% CI： 1.003–1.803， p = 0.047）、直肠真杆菌组（OR： 1.316， 95% CI： 1.043–1.660， p = 0.020）和丁酸弧菌属（OR： 1.109， 95% CI： 1.003–1.227， p = 0.044）与更高的降主动脉直径（DAD）风险存在名义关联，而瘤胃真杆菌组（OR： 0.877， 95% CI： 0.773–0.996， p = 0.043）则与更低的DAD风险存在名义关联。然而，在进行FDR校正后，所有这些关联均不再具有统计学显著性（pFDR> 0.05）。此外，这些名义上的IVW发现并未得到其他MR方法（MR-Egger、加权中位数、加权众数）的一致支持。
菌群-主动脉表型关联的网络分析
为了可视化复杂的相互作用关系网络，我们构建了一个包含所有潜在关联的网络图。分析揭示了以主动脉表型为中心的三个不同的集群。值得注意的是，在DAD中发现了一个促炎症集群，其中肠杆菌目及其所属的肠杆菌科均与直径增加呈正相关。这表明在分类学上相关的一组微生物可能具有相似的功能倾向，共同促成该表型。对于AAD，网络图突出了高度的复杂性和功能异质性；例如，在毛螺菌科家族中，毛螺菌科ND3007组和毛螺菌科NK4A136组这两个不同的属显示出相反的作用。对于TAA风险本身，网络图清晰地划分了风险因素（如草酸杆菌科）和保护因素（如变形菌门，其在名义水平上显示出最强的保护信号）。
敏感性分析
对于与AAD变化显著相关的肠道菌群，MR-Egger回归表明分析未受到水平多效性的影响。Cochran’s Q分析和漏斗图进一步显示没有显著异质性的证据。
对于与DAD变化显著相关的肠道菌群，MR-Egger回归表明分析未受到水平多效性的影响。对于最初与DAD变化无统计学相关性的疣微菌纲，MR-Egger回归表明未受水平多效性影响，但MR-PRESSO提示该分析中存在显著异常值。在异常值校正后，观察到疣微菌纲与DAD变化之间存在名义关联。
对于与TAA风险显著相关的肠道菌群，MR-Egger回归表明分析未受到水平多效性的影响，但毛螺菌科UCG008属和XIII UCG001属除外。然而，MR-PRESSO未在这些类群中检测到显著异常值。
MR-Egger回归表明未受水平多效性影响，但MR-PRESSO提示存在显著异常值。在调整异常值后，观察到这两个类群与TAA发病率存在名义关联。留一法分析显示，没有任何单个SNP对结果产生不成比例的影响，支持了探索性发现的稳定性。
讨论
本研究利用MR方法探索了肠道菌群与TAA之间的名义关系。我们的分析提示，在欧洲血统人群中，肠道菌群与TAA存在遗传学上的名义关联。
本研究揭示了可能影响胸主动脉瘤发展和主动脉直径改变的潜在相关性。值得注意的是，观察到的大肠杆菌志贺氏菌属和Allisonella属与TAA的正相关，提示了值得进一步研究的潜在微生物模式。大肠杆菌志贺氏菌属为革兰氏阴性、兼性厌氧、不产孢、无动力的杆菌，可能逃避免疫监视并引发肠道炎症，这可能假设性地促成血管病理，但这仍需验证。Allisonella属是韦荣球菌科的一个革兰氏阴性、卵圆形的属，以其产生组胺的能力和无运动性而闻名。它在组胺生成过程中调节组胺水平（一种炎症介质）的作用可能提供了一种机制假说，但仍然是推测性的。多种统计方法的一致发现强化了肠道菌群与主动脉健康之间的联系，尽管证据仍处于探索阶段。
艾格特菌属与升主动脉直径的关联，暗示了该菌属在主动脉扩张中的潜在作用。迟缓埃格特菌是一种不产孢、厌氧的革兰氏阳性杆菌，其功能尚不明确。瘤胃球菌科UCG-002显示出对TAA的保护作用，提示其可能有益于降低动脉瘤风险。然而，一项MR分析显示，更高水平的瘤胃球菌科UCG014属与TAA存在因果关系。这种不一致可能归因于临床特征的差异或同一属内的变异。本研究的网络分析进一步强调了单个细菌家族内部功能异质性的原则。例如，在毛螺菌科家族中，我们发现毛螺菌科ND3007组与升主动脉直径增加相关，而毛螺菌科NK4A136组则显示出保护作用。这一发现告诫我们不应概括整个细菌家族的功能，并突显了未来研究需要达到物种甚至菌株水平分辨率的必要性。此外，尽管属于同一属，其所属科可能不同，这也可能是导致观察到的效应各异的原因。
此外，观察到的各种类群与降主动脉直径变化之间的关联，例如直肠真杆菌组的存在，突显了肠道菌群对不同主动脉区域的复杂影响。本研究的网络分析支持这一点，揭示了一组独特的微生物群，包括直肠真菌组、肠杆菌科和肠杆菌科，它们都与降主动脉直径增加相关。这些分类学上相关、具有促炎潜力的细菌（已知是内毒素脂多糖的来源）的汇聚，提示了一种可能的共同炎症通路，尽管这仍有待实验验证。在腹主动脉瘤患者的肠道中，直肠真杆菌与有害细菌（如肠杆菌属和克雷伯菌属）共存，这与在其他心血管疾病中观察到的模式惊人地相似。这种一致性进一步强调了肠道菌群组成与主动脉不同节段健康之间复杂的相互作用，暗示了其对理解和管理心血管健康的潜在意义，但其机制含义仍是初步的。
本研究有几个优势：它评估了肠道菌群与TAA之间的双向潜在关系，并通过粪便检查评估了这些关系，为理解TAA结局提供了见解。然而，本研究也有一些局限性。首先，虽然本研究中使用的GWAS汇总数据的大多数参与者为欧洲血统，但需要进一步研究来确定这些结果是否适用于其他种族。其次，细菌类群仅在属水平进行分析，而未在更具体的水平（如物种或菌株）进行分析。因此，可能无法捕捉与细菌类群相关的所有遗传变异，尤其是那些罕见的变异。在微生物组GWASs中使用先进的全基因组鸟枪法测序可能产生更具体和准确的结果。第三，我们的研究使用了主要涉及成人的荟萃分析中的肠道菌群数据，忽略了其对儿童的影响。需要进一步的研究来阐明潜在的机制，并在更大的队列中验证这些关联。第四，尽管我们采用了多种敏感性分析来检测和校正水平多效性，但不能完全排除未知多效性通路的残余混杂可能性。重要的是，IVW方法识别的所有关联在经过FDR校正后均不再显著，并且这些名义上的发现并未得到其他MR方法的一致支持，进一步表明支持稳健因果效应的证据有限。此外，探索肠道菌群调节主动脉瘤的机制值得进一步研究。
结论
我们的因果推断分析提示肠道菌群与TAA之间存在名义上的遗传关联。这些发现提供了与胸主动脉瘤和主动脉直径性状相关的潜在微生物模式的探索性证据。虽然这些关联在经过FDR校正后不再显著，且未在多种MR方法中得到一致支持，但它们突出了可能值得进一步研究的候选微生物类群。未来需要使用更大的微生物组GWAS数据集、物种或菌株水平的分辨率以及实验验证，来澄清这些初步观察结果的生物学相关性，并确定肠道菌群是否可能参与主动脉病理。
