《Horticulture Advances》：Integrative genomic resequencing and transcriptome atlas identify InDel markers for identifying tea plants resistant to anthracnose
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本研究通过全基因组重测序和转录组分析，鉴定出与茶树炭疽病抗性相关的特异性InDel标记。研究人员开发了CsRc标记，定位在Chr10染色体123,508,930 bp位点，能有效区分抗病（590 bp/杂合带）与感病（431 bp）茶树基因型，在206个品种中验证准确率达88.59%。该标记位于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因内，揭示了ATP在植物免疫中的关键作用，为茶树抗病育种提供了高效分子工具，显著缩短育种周期。
茶（Camellia sinensis）作为广受欢迎的饮品，其健康益处日益受到认可，具有缓解心理压力的神经松弛作用和潜在的化学预防癌症功效。然而，茶树在生长过程中面临着多种生物和非生物胁迫的挑战，其中由Colletotrichum camelliae引起的炭疽病尤为严重，主要侵染叶片和木质枝条，导致生长严重受阻和茶叶品质下降。传统的育种方法虽然仍是植物病理学计划的核心，但其可扩展性和时间限制阻碍了遗传进展。分子标记技术的发展为精准、高效地鉴定和选育抗病品种提供了新途径，其中插入-缺失（InDel）标记因其分布广泛、密度高、变异低、多态性强且易于检测，在植物抗病育种中显示出巨大潜力。然而，关于茶树炭疽病抗性分子标记的开发和应用的报道仍然缺乏。本研究旨在填补这一空白，通过整合基因组学和转录组学方法，开发能够有效区分茶树炭疽病抗/感基因型的分子标记。
为开展此项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：首先，选取抗病品种“水仙7号”（SX7）和感病品种“岭头单丛”（BY）作为研究材料，进行了全基因组重测序，以鉴定全基因组范围内的单核苷酸多态性（SNP）和InDel变异。其次，对炭疽病菌接种5天后的叶片进行转录组测序（RNA-seq），分析差异表达基因（DEG），并通过京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析确定了与植物-病原体互作通路相关的基因。最后，结合重测序发现的InDel位点和转录组确定的抗病相关候选基因区间，设计并筛选了特异性InDel标记引物，并在包含206个不同茶树品种的群体中进行了PCR验证和基因型-表型关联分析。
基因组重测序
通过对SX7和BY进行全基因组重测序，共鉴定出33,454,128个SNP位点和4,370,229个InDel标记。分析发现，InDel长度分布以1-20 bp为主，其中单核苷酸InDel最为丰富。大多数InDel（83.5%）位于基因间区（INTERGENIC），而编码序列（CDS）区域分别鉴定出11,312个（SX7）和11,393个（BY）InDel，这些变异可能导致基因功能改变。
转录组测序和差异表达基因鉴定
对接种炭疽病菌后的SX7和BY叶片进行转录组分析，共鉴定出5,001个差异表达基因（DEG），其中479个为两品种共有。KEGG通路富集分析显示，这些基因显著富集于MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）信号通路、苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成等通路，其中植物-病原体互作通路占14.84%。通过实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）对选定的6个植物-病原体互作通路相关基因进行验证，结果证实了RNA-seq数据的可靠性。
InDel标记的筛选与验证
基于转录组KEGG分析确定的植物-病原体互作通路候选基因，研究人员从基因组重测序数据中筛选出位于这些基因内、且长度大于50 bp的InDel多态性位点。从最初设计的139对InDel标记引物中，筛选出具有多态性的引物。最终开发出的标记CsRc，其引物序列为：CsRc-InDel-F: ACTCGGTCAAAGCAAGGCAT；CsRc-InDel-R: GACACACCAGTTTGAAATGGCA。该标记被定位在10号染色体（Chr10）的123,508,930 bp位置。PCR扩增结果显示，产生590 bp条带或杂合条带的茶树表现为抗病，而产生431 bp条带的则为感病。在206个不同茶树品种中进行验证，该标记的基因型与炭疽病抗性表型的匹配率达到88.59%，证明其具有较高的准确性，可用于茶树炭疽病抗性的高通量筛选。
标记位点的基因分析
CsRc分子标记位点位于基因CSS0015304内部。KEGG注释将该基因归类于植物-病原体互作通路，而直系同源群（KOG）数据库注释其为信号转导机制中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。基因本体（GO）富集分析强调了其ATP结合的关键功能。比较转录组分析显示，与ATP依赖活性相关的基因在抗病品种SX7中相较于感病品种BY显著上调。这符合真核生物蛋白激酶（Hanks型激酶）的保守催化核心结构，其N端赖氨酸残基附近的甘氨酸富集基序对ATP结合至关重要。细胞外ATP（eATP）作为一种损伤相关分子模式（DAMP），在植物免疫中扮演重要角色。植物受损后，eATP浓度升高，与细胞表面受体（如P2K1和P2K2）结合，启动下游信号事件，导致防御相关基因的上调及防御物质（如抗性蛋白和酚类化合物）的产生，从而增强植物的抗病性。
本研究的结论表明，通过整合抗/感炭疽病茶树品种（SX7和BY）的全基因组重测序和接种后转录组数据，成功鉴定并开发了一个与炭疽病抗性相关的特异性InDel标记CsRc。该标记能有效区分抗病与感病基因型，在206个品种中验证显示出高准确率，为茶树抗炭疽病育种提供了高效的分子工具。讨论部分深入阐述了分子标记技术，特别是InDel标记，在作物遗传分析和育种中的广泛应用及优势。研究强调了ATP在植物免疫信号转导中的核心作用，eATP通过结合膜受体P2K1/P2K2，激活MAPK级联反应等通路，调控防御基因表达，从而增强植物抗性。该标记的开发不仅有助于加速抗病茶树品种的选育进程，缩短育种周期，也为深入理解茶树应对炭疽病菌侵染的分子机制提供了新的见解。研究成果发表在《Horticulture Advances》期刊上，对推动茶树分子育种和可持续农业发展具有重要意义。
