《Drug Delivery and Translational Research》：Microbubble-free mechanical sonoporation for MR-guided drug delivery in solid tumours: a proof-of-concept study
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本文针对目前基于微泡（MB）的声孔化技术在临床转化中面临的半衰期短、成本高和外源性细胞毒性等问题，提出了一种新型的无微泡机械性声孔化（Microbubble-free sonoporation）策略。研究人员通过优化低强度非聚焦超声参数（1 MHz, MI 0.25），成功实现了亲水性药物/显像剂（如Gadoteridol和PI）的高效细胞内递送，在维持细胞活性>70%的同时，证实了其在体内外均可增强并延长肿瘤内药物蓄积与MRI信号。此项研究首次展示了将无微泡声孔化与MRI监控相结合，为实体瘤的图像引导治疗提供了一种更安全、可控且具转化潜力的递送新方法。
在精准医疗的时代，如何将治疗药物或诊断试剂高效、精准地递送到病灶部位，尤其是肿瘤细胞内，一直是生物医学领域的热点与难点。超声（Ultrasound, US）介导的药物递送，因其无创、局部可控等特点而备受关注。传统上，这种技术多依赖于“微泡”（Microbubbles, MBs）作为声波放大器来增强细胞膜的通透性，即“声孔化”（Sonoporation）。这些外源性微泡在超声波作用下会发生振荡、破裂，产生局部能量，暂时在细胞膜上打开小孔，帮助药物进入。这听起来像是一对黄金搭档，对吗？
然而，现实往往比理想骨感。这些外来的微泡“助手”自身也存在不少麻烦：它们在体内的半衰期很短，容易被快速清除；制备和使用成本不菲；更令人担忧的是，其潜在的细胞毒性和可能引起的组织损伤风险，为临床应用蒙上了一层阴影。有没有可能抛开这些“不完美”的助手，直接利用超声波自身的机械力，安全地打开细胞大门呢？这正是本研究团队试图解答的核心问题。
近日，一项发表于《Drug Delivery and Translational Research》杂志的研究，题为“Microbubble-free mechanical sonoporation for MR-guided drug delivery in solid tumours: a proof-of-concept study”，为我们带来了一个令人振奋的答案。研究者们开发并验证了一种无需微泡、完全依靠机械力驱动的声孔化新方法，并将其与磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging, MRI）监控无缝结合，为实体瘤的图像引导治疗开辟了新路径。
为了开展这项研究，作者团队运用了多个关键技术方法。首先，他们搭建了一套精密的超声刺激系统，由波形发生器、射频功率放大器、衰减器和压电陶瓷平板换能器（1 MHz）组成，可精确调控声压（Acoustic Pressure, AP）、占空比（Duty Cycle, DC）和脉冲重复频率（Pulse Repetition Frequency, PRF）等关键参数。其次，他们采用了一种专利的超声兼容培养板系统，确保细胞在超声处理过程中的均一暴露。在体外实验中，主要使用了人髓系白血病细胞（K562）、小鼠乳腺癌细胞（TS/A）、人卵巢癌细胞（A2780）和小鼠巨噬细胞（J774A.1）等多种细胞系，以评估技术的普适性。在体内实验中，他们建立了K562细胞荷瘤的裸鼠模型。核心的检测手段包括：通过弛豫度测量和电感耦合等离子体质谱（Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry, ICP-MS）定量细胞内钆（Gadolinium, Gd）离子含量；通过荧光分光光度法检测模型药物碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）的摄取；利用活细胞成像和台盼蓝（Trypan Blue）排斥实验评估细胞活力和膜再封闭动力学；通过检测活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）水平评估细胞应激；并通过7T高场强MRI进行体内外成像，以及激光共聚焦荧光显微镜进行肿瘤组织切片分析。
研究结果
1. In vitro sonoporation setup and optimization （体外声孔化参数设置与优化）
研究者首先系统优化了超声参数，以期在保证高细胞活性（>70%）的同时，实现高效的MRI造影剂Gadoteridol内化（目标：>7×109Gd离子/细胞）。他们发现，Gadoteridol的摄取量随声压（AP）和占空比（DC）的增加而显著增加，而细胞活力则随之下降。通过双因素方差分析（Two-way ANOVA）和Bonferroni事后检验，他们确定了在声压0.25 MPa（对应机械指数MI 0.25）、占空比25%、脉冲重复频率1 Hz的条件下，可达到最佳平衡：实现平均7.63×109Gd离子/细胞的高摄取，同时细胞活力保持在74.69%的可接受水平。
2. Cell proliferation, membrane resealing, and molecular uptake efficiency （细胞增殖、膜再封闭与分子摄取效率）
研究表明，在优化参数下，声孔化处理（无论是否伴有Gadoteridol）对K562细胞的增殖能力均无显著影响。膜完整性评估显示，细胞膜在超声处理后约30分钟内完全再封闭。比较不同分子大小的探针发现，虽然单体Gadoteridol与其四聚体Gado4的每个细胞Gd离子摄取量无差异，但Gadoteridol的分子摄取量约为Gado4的四倍，表明分子大小影响内化效率。该技术在不同细胞系（K562, TS/A, A2780, J774A.1）中均有效，其中TS/A细胞摄取效率最高。
3. Comparison of cell labelling methods （细胞标记方法比较）
研究将无微泡声孔化与三种传统细胞标记/通透化方法——胞饮作用（Pinocytosis）、电穿孔（Electroporation）和低渗肿胀（Hypotonic Swelling）进行了对比。在细胞活力方面，胞饮作用最佳（~100%），低渗肿胀次之（~90%），声孔化（~80%）优于电穿孔（~70%）。在Gadoteridol摄取效率上，电穿孔最高，声孔化与低渗肿胀相当，均显著高于胞饮作用。在诱导细胞氧化应激（ROS产生）方面，电穿孔最高，声孔化与低渗肿胀仅引起适度增加，而胞饮作用无影响。这表明无微泡声孔化在效率、安全性和应激水平之间取得了良好平衡。
4. In vitro internalisation of gadoteridol and propidium iodide （体外钆特醇和碘化丙啶的内化）
弛豫度测量和MRI成像分析揭示，通过声孔化进入细胞的Gadoteridol显示出比通过长时间胞饮作用进入的更高的纵向弛豫率（R1obs）和T1加权（T1-weighted, T1w）MRI对比度。这表明声孔化促使造影剂直接进入细胞质，避免了胞饮作用导致的造影剂被困于内吞小泡（endosome）中而产生的“弛豫淬灭”（relaxivity quenching）效应，从而在MRI上产生更强的信号。同时，实验证实Gadoteridol与模型药物PI能以固定比例（1000:1）被协同高效内化，且二者摄取呈线性相关，互不干扰，证明MRI造影剂可作为药物递送的有效示踪剂。
5. In vivo MRI evaluation of sonoporation-mediated delivery （体内MRI评估声孔化介导的递送）
在K562荷瘤裸鼠模型中，静脉共同注射Gadoteridol和PI后，立即对肿瘤部位进行局部超声处理。MRI结果显示，与未处理组相比，声孔化处理组肿瘤区域的T1对比增强（T1Enh）显著更强且持续时间更长（超过48小时），而未处理组对比度在30分钟内即恢复基线。离体激光共聚焦显微镜显示，仅在声孔化处理的肿瘤组织中观察到强烈的PI红色荧光信号（与细胞核共定位），证实了药物的细胞内累积。对肿瘤组织的定量分析（ICP-MS测Gd，荧光法测PI）进一步证实，声孔化使肿瘤内Gadoteridol和PI的含量分别比对照组提高了约4.5倍和7.4倍，且这种富集具有肿瘤特异性（与肌肉组织相比）。
结论与讨论
本研究成功提出并验证了一种创新的、无微泡的机械性声孔化平台。该技术利用优化的低强度非聚焦超声参数，能够在不依赖外源性微泡的情况下，高效、可控地实现小分子药物和显像剂向细胞质内的递送。其在体外展现出相较于电穿孔更低的细胞应激，相较于低渗肿胀更好的体内应用前景，以及相较于传统胞饮作用更高的递送效率。
其核心优势在于：第一，避免了微泡相关的局限性，如短半衰期、额外成本和潜在毒性，提升了临床转化的可行性。第二，该技术诱导形成的膜孔可能更小、闭合更缓（约30分钟），这有利于维持细胞活力与功能，同时允许分子直接进入细胞质，避免了内吞途径导致的“弛豫淬灭”，从而显著增强了MRI的示踪能力。第三，体内实验证实了该技术能有效促进药物和显像剂在实体瘤内的特异性蓄积和延长滞留，为图像引导的肿瘤治疗提供了有力工具。
当然，该技术目前主要适用于小分子物质（如本研究中的Gadoteridol，分子量约559 Da）的递送，对于基因等大分子的递送能力尚待探索。然而，其能够实现治疗药物与MRI造影剂的协同递送与实时监控，为开发“诊疗一体化”（Theranostics）策略铺平了道路。未来，将该平台应用于更多类型的治疗药物，并整合更先进的实时成像技术，将推动这一有前景的方法进一步走向临床，为实体瘤的精准、微创治疗提供新方案。
