《Journal of Plant Growth Regulation》：Molecular Mechanisms Underlying Fading of the Reddish Color in the Peel of Yamashitabeni-wase (Citrus unshiu Marcow.)
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为了揭示早熟温州蜜柑'山下红早生'果实红色外皮在1月褪色的分子机制，研究人员围绕类胡萝卜素代谢展开研究，发现低温抑制了红色脱辅基类胡萝卜素β-香堇黄素(β-citraurin)的生物合成基因CitCCD4的表达，并首次明确了CitCCD1酶可降解β-香堇黄素，从而提出了完整的β-香堇黄素代谢通路，为改善柑橘果实外观色泽提供了新见解。
想象一下，在琳琅满目的水果货架上，一个橙红鲜亮的柑橘有多么诱人。对于早熟温州蜜柑的一个品种'山下红早生'(Yamashitabeni-wase)而言，其独特的橙红色外皮是其吸引消费者的关键品质。这种迷人的色泽主要归功于果皮中积累的一种红色脱辅基类胡萝卜素——β-香堇黄素(β-citraurin)。然而，果农们发现了一个恼人的现象：通常在12月达到色泽巅峰的果实，进入1月后，那抹亮红色便开始褪去，逐渐变成带有红色斑点的橙色。这种"褪色"现象严重影响了果实的市场接受度和消费者偏好。尽管此前的研究已经揭示了β-香堇黄素是如何在柑橘中合成的，但关于它是否会进一步被分解代谢、以及为何在1月会减少，仍然是一个未解之谜。为了解开'山下红早生'果皮红色褪去的分子机制，来自日本静冈大学的研究团队展开了一项深入的研究，相关成果发表在学术期刊《Journal of Plant Growth Regulation》上。
为了探究这一现象背后的原因，研究人员系统性地采用了多种技术方法。他们以日本静冈县种植的十年生'山下红早生'果实为研究对象，在2020年至2022年的不同时间点（11月、12月、1月）进行采样。首先，使用色差计对果实外观颜色进行量化分析，计算色调角(H°)和柑橘色泽指数(CCI)来客观评估颜色变化。其次，通过高效液相色谱(HPLC)技术精确测定果皮（黄皮层）中包括β-香堇黄素在内的多种类胡萝卜素和脱辅基类胡萝卜素的含量动态。再者，利用定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术，分析了与类胡萝卜素合成和降解相关的多个关键基因的表达模式，特别是生物合成基因CitPSY、CitPDS、CitLCYb等，以及裂解基因CitCCD4和CitCCD1。此外，研究还设置了不同温度（5°C, 10°C, 15°C）的采后储存实验，以模拟冬季低温环境，探究温度对基因表达和色素积累的影响。最后，通过分子克隆技术将CitCCD1基因在大肠杆菌中表达并纯化出重组蛋白，在体外（in vitro）酶活实验中验证了其对β-香堇黄素的降解活性，并利用质谱(DART MS)等技术鉴定了降解产物。
研究结果
外部颜色的变化
研究人员首先观察了果实成熟过程中外观颜色的变化。果皮颜色从11月开始由黄色转为橙红色，12月呈现出饱满的红色，但进入1月后，红色开始褪去，变为带有红色斑点的橙色。量化指标CCI值在12月达到峰值后于1月下降，而H°值则在12月降至低点后于1月略有回升，这与肉眼观察到的褪色现象完全吻合。
类胡萝卜素和脱辅基类胡萝卜素含量的变化
对果皮中色素含量的分析显示，主要的类胡萝卜素如β-隐黄质(β-cryptoxanthin)、全反式堇菜黄质(all-trans-violaxanthin)和9-顺式堇菜黄质(9-cis-violaxanthin)的含量从11月到1月逐渐增加。然而，关键的红色色素β-香堇黄素的含量却在11月至12月快速增加并达到峰值后，于1月显著下降。这一下降与果皮红色的褪去在时间上高度一致，直接表明β-香堇黄素的积累是决定果皮红色的关键。
类胡萝卜素代谢基因表达的变化
为了从分子层面理解颜色变化，研究人员检测了相关基因的表达动态。负责β-香堇黄素生物合成的关键基因CitCCD4的表达量在11月至12月期间上升，但在1月急剧下降至甚至低于11月的水平。而另一个类胡萝卜素裂解双加氧酶基因CitCCD1的表达量则在12月达到峰值，尽管1月有所回落，但仍显著高于11月的水平。这表明，1月份β-香堇黄素的减少可能同时受到合成减少和降解增加的双重影响。
温度对CitCCD4表达和β-香堇黄素积累的影响
研究监测到，1月份果园的平均温度降至5°C以下。为了验证低温的作用，他们进行了采后温度控制实验。结果显示，储存在5°C下的果实呈现橙色，而储存在10°C和15°C下的果实则保持橙红色。相应地，在5°C下储存的果实，其CitCCD4基因的表达水平和β-香堇黄素的含量均显著低于在10°C和15°C下储存的果实。这证明，1月份的低温是抑制CitCCD4表达、从而限制β-香堇黄素生物合成的主要原因。
重组CitCCD1酶的功能分析
一个重要的新发现是β-香堇黄素可能被进一步降解。体外酶活实验表明，重组CitCCD1蛋白能够切割β-香堇黄素。高效液相色谱分析检测到两个产物峰，经质谱和光谱鉴定，分别为3-羟基-β-紫罗兰酮(3-hydroxy-β-ionone)和C17二醛(C17dialdehyde)。这证实CitCCD1可以在β-香堇黄素的C9-C10双键处进行切割，从而降解这种红色色素。
研究结论与讨论
本研究首次为柑橘果实中的β-香堇黄素描绘了一条完整的代谢通路。在该通路中，CitCCD4酶负责从β-隐黄质和玉米黄质(zeaxanthin)的C7-C8或C7’-C8’双键处切割，生成β-香堇黄素。随后，CitCCD1酶可以进一步在β-香堇黄素的C9-C10双键处进行切割，将其降解为3-羟基-β-紫罗兰酮和C17二醛。
研究明确指出，'山下红早生'果实在1月褪色是内外因共同作用的结果。外因是环境温度降至5°C以下，显著抑制了生物合成关键基因CitCCD4的表达，切断了红色色素的主要来源。内因则是降解基因CitCCD1在1月仍维持在相对较高的表达水平，可能导致已合成的β-香堇黄素被持续分解。两者共同导致了果皮中β-香堇黄素含量的净下降，从而引发褪色。
这一发现具有重要的理论和实践意义。在理论上，它扩展了我们对植物类胡萝卜素代谢网络的认识，特别是揭示了脱辅基类胡萝卜素也可以作为底物被进一步代谢，并强调了类胡萝卜素裂解双加氧酶(CCD)家族成员在精细调控色素积累中的平衡作用。在实践上，该研究为柑橘产业提供了直接的指导。为了避免或减轻冬季低温导致的果实褪色，可以采取相应的农艺措施，例如在低温来临前适时采收，或探索利用植物激素（如茉莉酸JA）调控CitCCD4基因表达的可能性。此外，这一完整的代谢通路图为未来通过分子育种手段，定向选育或改造柑橘品种、培育色泽更鲜艳且更稳定的新品系提供了潜在的基因靶点。最终，这些努力将有助于提升柑橘果实的外观品质和商品价值，更好地满足市场需求。
