《Journal of Plant Pathology》：First report of Neopestalotiopsis clavispora causing leaf spot disease on rubber in Colombia
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为解决哥伦比亚橡胶树（Hevea brasiliensis）新发叶斑病的病原鉴定问题，研究人员从RRIM 600克隆病叶上分离纯化菌株NC2_Meta，通过形态学观察、分子鉴定（ITS和TEF1-α测序及系统发育分析）和柯赫氏法则验证，首次确认其病原为棒孢新拟盘多毛孢（N. clavispora）。该研究为南美橡胶生产提供了关键的病害诊断依据。
论文解读文章
在广阔的南美洲热带丛林中，橡胶树是经济命脉之一。然而，这些绿色“金矿”的健康正受到未知病害的威胁。2021年10月，在哥伦比亚普埃尔托加伊坦的Mavalle公司种植园里，技术人员发现了一种令人担忧的现象：部分橡胶树（克隆RRIM 600）的叶片上出现了神秘斑点，发病率达到了10-20%。这些斑点呈浅褐色，圆形或椭圆形，中心颜色更深，周围环绕着黄色晕圈，边缘清晰，质地干燥且带有同心环纹，表面还能观察到黑色的产孢结构。这显然不是正常的生理现象，而是一种病害。橡胶树一旦大面积染病，将直接影响胶乳产量，进而冲击当地的橡胶产业。面对这种新出现的叶斑病，一个紧迫的问题摆在植物病理学家面前：这究竟是什么病原体引起的？
为了回答这个问题，一篇发表在《Journal of Plant Pathology》上的研究由此展开。研究团队奔赴现场，从病叶上采集样本，他们的目标非常明确：分离并鉴定致病的“元凶”。通过一系列严谨的科学侦探工作，研究人员不仅揪出了病原，还揭示了其在哥伦比亚乃至南美地区的潜在风险。
为了开展这项研究，作者主要运用了以下几项关键技术方法：首先是从哥伦比亚普埃尔托加伊坦发病橡胶树叶片上分离病原菌；其次，通过形态学观察（依据Maharachchikumbura等人的分类标准）进行初步鉴定；第三，采用分子生物学方法，使用特异性引物（ITS1/ITS4和EF1-526 F/EF1-1567R）对菌株的ITS（Internal Transcribed Spacer，内部转录间隔区）和TEF1-α（Translation Elongation Factor 1-alpha，翻译延伸因子1-α）基因区域进行PCR扩增和测序，并将序列提交至GenBank数据库（登录号：ITS: PV784037; TEF1-α: PX120869）；第四，利用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool，基本局部比对搜索工具）进行序列比对和构建系统发育树进行分子鉴定；最后，遵循柯赫氏法则（Koch’s postulates），通过回接接种健康橡胶树幼苗验证病原性。
研究结果
病原菌分离与形态学特征
从具有症状的橡胶树叶片上成功分离到菌株NC2_Meta。该菌落在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上呈白色、棉絮状、圆形，中心微凸。其分生孢子为纺锤形，具5个隔膜，平均大小为9.63 ± 0.3 μm × 2.71 ± 0.2 μm，顶端有2-3根附属丝（平均长度约7.23 μm）。根据这些形态特征，研究人员初步将其归为新拟盘多毛孢属（Neopestalotiopsis）。
分子鉴定与系统发育分析
为进一步精确认定，研究人员对分离菌株NC2_Meta的ITS和TEF1-α基因进行了测序分析。BLAST比对结果显示，其ITS和TEF1-α序列与棒孢新拟盘多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora）的参考序列具有高于99.3%的一致性。基于ITS和TEF1-α基因联合序列构建的系统发育树进一步证实，菌株NC2_Meta与棒孢新拟盘多毛孢的标准菌株PS110、SGP39和CBS44773紧密聚类在同一分支中，并获得了高达0.99的后验概率支持。这从分子水平上确认了其身份。
病原性测定
根据柯赫氏法则，研究人员对分离纯化的真菌进行了致病性验证。他们将浓度为6 × 104conidia mL-1的分生孢子悬浮液（含0.05% Tween 80）喷洒到五株健康橡胶树幼苗的消毒叶片上。作为对照的植株仅喷洒含有Tween 80的无菌蒸馏水。在25°C和85-90%相对湿度的条件下培养，接种后的5-7天内，处理组的叶片上就出现了与田间观察一致的叶斑症状，而对照组在整个实验期间均保持无症状。随后，研究人员从这些新发病的叶片组织中再次分离到了与接种菌株形态一致的病原菌，从而完整地满足了柯赫氏法则的全部要求，确证了该菌的致病性。
研究结论与意义
本研究通过综合运用形态学、分子生物学和柯赫氏法则验证，首次明确报道了棒孢新拟盘多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora）是引起哥伦比亚橡胶树叶斑病的病原。这是该病原在哥伦比亚橡胶树上的首次记录。
此项发现的科学意义与实践价值十分显著。首先，它填补了哥伦比亚橡胶树病害名录中的一项空白，为该地区橡胶树病害的准确诊断提供了关键的病原学依据。其次，研究揭示了棒孢新拟盘多毛孢的地理分布范围已扩展至南美洲，这对于理解该病原的全球分布格局和潜在传播路径具有重要意义。更重要的是，这一发现向哥伦比亚乃至南美地区的橡胶种植者和植物检疫部门发出了警示：一种新的、具有明确致病性的叶斑病病原已经存在，并且可能对橡胶产业构成潜在威胁。它为后续开展针对性的病害监测、流行规律研究和防治策略制定奠定了坚实的基础，对于保障南美橡胶生产的稳定与安全具有重要的现实意义。
