《Investigational New Drugs》：Selective cytotoxicity of solamargine via oxidative stress and caspase-independent mechanisms in human glioblastoma cells
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本文针对标准治疗耐药、预后极差的IDH野生型胶质母细胞瘤(IDH-wildtype GB)探索新的治疗策略。研究者聚焦于天然产物龙葵碱(Solamargine, SM)，评估了其在常氧和缺氧条件下，单独或与替莫唑胺(TMZ)联用，对人源IDH野生型胶质母细胞瘤细胞系(U-87MG, U-251MG, T98-G)及非肿瘤星形胶质细胞(NHA)的增殖、克隆形成、形态、迁移等生物学行为的影响。研究发现SM展现出剂量和时间依赖性的选择性细胞毒性，其效应在缺氧条件下增强，并揭示了其通过诱导G2/M期阻滞、氧化应激和DNA损伤（表现为γH2AX表达升高），但不依赖于caspase-3和p53的非经典细胞死亡机制。尽管与TMZ联用主要表现出拮抗效应，但SM本身被证明是针对这一难治性肿瘤的潜在候选药物，为克服缺氧微环境带来的治疗抵抗提供了新思路。
胶质母细胞瘤，尤其是IDH野生型(IDH-wildtype)的亚型，是成人中枢神经系统中最常见且最致命的原发性恶性肿瘤。其标准治疗方案是最大程度的安全手术切除，随后辅以放疗和替莫唑胺(TMZ)化疗。尽管如此，患者的预后仍然极其严峻，中位总生存期仅约15个月，五年生存率不足10%。这种治疗困境背后，是IDH野生型胶质母细胞瘤一系列顽固的生物学特性：高度的遗传异质性、弥漫浸润性生长、血脑屏障(Blood-Brain Barrier)对药物的阻碍，以及肿瘤内部常存在的缺氧微环境。其中，缺氧尤为关键，它不仅驱动肿瘤的侵袭和免疫逃逸，还直接导致肿瘤细胞对放疗和TMZ产生抵抗。此外，部分肿瘤细胞高表达的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)能修复TMZ造成的DNA损伤，进一步削弱了TMZ的疗效。面对这些挑战，从天然产物中寻找具有新颖作用机制的活性分子，成为开发新疗法的热点方向。
在此背景下，来自植物龙葵(Solanum)的甾体糖苷生物碱——龙葵碱(Solamargine, SM)进入了研究者的视野。既往研究表明，SM在多种肿瘤模型中显示出广泛的细胞毒性和抗增殖活性。然而，SM针对难治的IDH野生型胶质母细胞瘤的作用，特别是其在肿瘤耐药核心——缺氧条件下的效果，以及与临床一线药物TMZ的联合应用潜力，尚不明确。为了填补这一空白，并探索克服胶质母细胞瘤治疗抵抗的新途径，研究人员开展了一项系统的体外研究。这项研究成果最终发表在《Investigational New Drugs》杂志上。
为了系统评估SM的潜力，研究者运用了多项关键的细胞和分子生物学技术。研究使用了三种人源IDH野生型胶质母细胞瘤细胞系(U-87MG, U-251MG, T98-G)和非肿瘤性人星形胶质细胞(NHA)作为对比。通过细胞代谢活性(XTT)测定，评估了SM和TMZ在常氧和缺氧条件下，单独或联合用药的细胞毒性及相互作用。利用克隆形成实验考察了SM对肿瘤细胞长期增殖能力的抑制。通过伤口愈合划痕实验评估了SM对细胞迁移能力的影响。借助相差显微镜和荧光显微镜(吖啶橙/溴化乙锭染色)观察了药物引起的细胞形态学变化。研究聚焦于反应最显著的U-87MG细胞，深入探讨其作用机制：使用流式细胞术(Muse Cell Analyzer)分析了细胞周期分布、细胞死亡(膜联蛋白V/7-AAD染色)和细胞内活性氧(ROS)水平；通过蛋白质印迹法(Western Blot)检测了DNA损伤标志物γH2AX、凋亡相关蛋白cleaved caspase-3和肿瘤抑制蛋白p53的表达变化。
Differential cytotoxic profiles of SM and TMZ, alone and in combination, under normoxic and hypoxic conditions (SM和TMZ在常氧和缺氧条件下单独及联合使用的差异细胞毒性谱)
研究首先证实了SM对三种胶质瘤细胞系均具有剂量和时间依赖性的细胞毒性，其半数抑制浓度(IC50)在5.04至9.53 μM之间，且对肿瘤细胞的选择性高于正常星形胶质细胞(选择性指数SI为1.4–2.0)。值得注意的是，在模拟肿瘤内部缺氧(5% O2)的条件下，SM对肿瘤细胞的杀伤效力反而增强，24小时IC50值均低于常氧条件。相比之下，TMZ单独使用时，即使在高达1500 μM的浓度下，对肿瘤细胞的杀伤作用也相当有限，而正常细胞对TMZ更为敏感。当SM与TMZ联用时，分析显示二者主要产生拮抗作用(组合指数CI > 1)，特别是在高浓度组合下，拮抗效应更为明显。这表明在所测试的方案下，联合用药并未产生协同增效，其效果主要由SM贡献。
Effects of SM on clonogenic growth, migration, and cellular morphology (SM对克隆形成生长、迁移和细胞形态的影响)
克隆形成实验显示，低至2.5 μM的SM即可显著抑制胶质瘤细胞的长期增殖能力，形成集落的能力大幅下降，而正常星形胶质细胞相对受影响较小，进一步证实了SM的选择性抗增殖作用。然而，在伤口愈合实验中，SM在测试浓度下并未显著影响肿瘤细胞的迁移能力，说明其抗肿瘤效应主要作用于增殖，而非运动侵袭。相差显微镜观察揭示了SM诱导的剧烈形态学改变：高浓度下，细胞在数分钟内就出现边缘回缩、变圆；暴露1小时后，出现广泛的细胞回缩、变圆和悬浮细胞比例增加；24小时后，细胞大量脱落，形成碎片，这与细胞活力的丧失和克隆形成能力的抑制结果一致。
SM-induced oxidative stress, DNA damage, and noncanonical cell death in U-87MG cells (SM在U-87MG细胞中诱导的氧化应激、DNA损伤和非经典细胞死亡)
深入的机制研究在U-87MG细胞中进行。结果显示，SM处理能显著诱导细胞内活性氧(ROS)水平升高，且在20 μM浓度下作用1小时即可引起急剧的ROS爆发。同时，SM导致了细胞周期进程的改变：暴露于7.68 μM浓度24小时后，细胞停滞在G2/M期。膜联蛋白V/7-AAD染色分析细胞死亡模式发现，SM处理导致了膜完整性逐渐丧失，表现为晚期凋亡/坏死(膜联蛋白V阳性/7-AAD阳性)细胞比例增加，但并未检测到典型的早期凋亡(膜联蛋白V阳性/7-AAD阴性)细胞显著增多。荧光显微镜观察也支持了细胞膜损伤和核变化。最关键的是，蛋白质印迹分析显示，SM处理后，DNA双链断裂的标志物磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)的表达显著上调，但经典的凋亡执行蛋白cleaved caspase-3和肿瘤抑制蛋白p53的水平并未发生变化。
研究的结论与讨论部分对上述发现进行了整合与阐释。SM在IDH野生型胶质母细胞瘤中表现出明确的选择性抗肿瘤活性，其效力在缺氧环境下不减反增，这是一个极具治疗潜力的特征。研究揭示了SM可能通过两种浓度/时间依赖的机制发挥作用：在高浓度短时暴露下，它可能通过其甾体结构与细胞膜胆固醇结合，导致膜结构崩解和快速细胞裂解；在低浓度长时暴露下，则引发一个更“程序化”的过程，包括氧化应激、DNA损伤信号激活、G2/M期阻滞，最终走向一种不依赖于caspase-3和p53的非经典细胞死亡途径，可能与溶酶体-线粒体通路或parthanatos（一种由DNA损伤过度激活PARP-1介导的程序性坏死）有关。
关于SM与TMZ的拮抗作用，研究者给出了合理的解释：SM引起的G2/M期阻滞减少了处于S期的细胞比例，而TMZ需要细胞进行DNA复制（即处于S期）才能将其造成的DNA损伤转化为致命的DNA错配修复(MMR)介导的细胞死亡信号。因此，SM将细胞“锁”在G2/M期，实际上缩小了TMZ发挥作用的“时间窗口”，导致拮抗。这也提示未来若考虑联合用药，需要精心设计给药顺序和时机。
本研究的重要意义在于，它首次系统评估了天然产物SM对IDH野生型胶质母细胞瘤——这一临床最具挑战性的脑肿瘤亚型——的体外抗肿瘤活性，并初步阐明了其不依赖于经典凋亡通路的作用机制，尤其是其在缺氧条件下仍能保持甚至增强效力的特性，为攻克肿瘤微环境导致的治疗抵抗提供了新的候选分子。尽管与TMZ的联用未显示出协同效应，但SM本身作为一个独立的作用单元，其独特的作用机制为开发针对胶质母细胞瘤，特别是其缺氧耐药区域的新疗法奠定了重要的临床前基础。研究也指明了未来需要深入探索的方向，如SM基于糖基结构的特异性摄取机制、具体的非凋亡性死亡通路（如parthanatos）的验证，以及进一步的体内药效学与药代动力学研究。
