《Molecular Imaging》：Template-Directed RIG-I Agonist Assembly for Image-guided Targeted Cancer Immunotherapy
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为解决RIG-I激动剂临床转化中面临的脱靶效应和递送难题，研究人员开发了一种基于肿瘤特异性RNA模板（如miRNA-21）的细胞内RIG-I激动剂组装新策略。通过超顺磁性纳米颗粒（TTX）递送5’-三磷酸单链RNA RIG-I激动剂（RIGA-miRNA-21），实现了特异性RIG-I信号激活和抗肿瘤免疫反应，并利用TTX的磁性特性通过磁共振成像（MRI）进行影像引导治疗。该策略在黑色素瘤模型中被证明可诱导肿瘤细胞凋亡、抑制生长并诱导免疫记忆，为肿瘤选择性先天免疫激活提供了新思路。
在癌症治疗领域，免疫疗法以其精准打击肿瘤细胞、降低毒副作用的潜力而备受瞩目。其中，利用人体自身的模式识别受体（Pattern Recognition Receptors, PRRs），如视黄酸诱导基因I（Retinoic acid-inducible gene I, RIG-I）样受体，来激活广泛的抗肿瘤反应，是一个极具前景的方向。这类受体能识别病毒等外来入侵者特有的分子模式，从而启动包括产生I型干扰素（Type I IFNs）在内的一系列免疫级联反应，不仅可以直接杀伤肿瘤细胞，还能激活适应性免疫，形成长期免疫记忆。然而，理想虽丰满，现实却骨感。RIG-I激动剂走向临床的道路上横亘着两大“拦路虎”。首先，由于RIG-I样受体在全身广泛表达，传统递送的双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）激动剂缺乏特异性，极易“误伤”正常细胞，引发脱靶效应和全身性免疫激活，带来严重毒副作用。其次，有效的递送系统是另一大挑战。裸露的寡核苷酸（oligonucleotide）难以穿过细胞膜、在体内易被降解，且常用的递送方法（如阳离子聚合物、PLGA颗粒、脂质纳米粒等）大多仍无法克服非特异性激活的难题，并且临床研究多采用瘤内注射，限制了其广泛应用。
面对这些挑战，一项发表在《Molecular Imaging》上的研究，提出了一种名为“模板导向的RIG-I激动剂自组装”的巧妙策略，旨在为肿瘤细胞“量身定制”一把激活免疫系统的“钥匙”，并实现可视化“追踪”治疗过程。研究人员设想，能否设计一种“前体”分子，它本身不具备激活能力，只有在进入特定的肿瘤细胞后，才会与肿瘤细胞中过量表达的某种“模板”结合，从而“组装”成激活RIG-I的完整形式？这样，免疫激活就能被精准地限制在肿瘤细胞内。他们选择了在多种肿瘤中高表达的微小RNA-21（microRNA-21, miRNA-21）作为“模板”，设计并合成了与其序列100%互补、且带有5’-三磷酸（5’-triphosphate, 5’-ppp）修饰的单链反义RNA寡核苷酸（RIGA-miR-21）。这个5’-ppp修饰是RIG-I识别病毒RNA、启动信号的关键“开关”。为了让这把“钥匙”能准确“快递”到肿瘤细胞，研究人员将其连接到一个经过验证的超顺磁性氧化铁纳米颗粒载体（TTX）上，形成了最终的纳米复合物TTX-RIGA-miR-21。这个载体不仅保护了RNA不被降解，还能通过增强的渗透和滞留效应（Enhanced Permeability and Retention effect, EPR）富集于肿瘤，其磁性核心更使得利用磁共振成像进行无创的“影像引导治疗”成为可能。其作用机制如所示：纳米颗粒进入细胞后，在还原性环境中二硫键断裂，释放出RIGA-miR-21；释放出的RIGA-miR-21与细胞内源的miRNA-21结合，形成具有5’-ppp末端的双链RNA（5’-ppp-dsRNA），这正是RIG-I的标准激活配体；随后，RIG-I识别并结合该双链结构，激活下游信号通路，导致I型干扰素和促炎细胞因子的释放，最终引发肿瘤细胞凋亡（apoptosis）并重塑肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME），激活T细胞，产生持久的抗肿瘤免疫。
为了验证这一策略，研究人员综合运用了多种技术方法。研究主要在小鼠B16-F10黑色素瘤模型中进行。关键技术方法包括： 1）纳米颗粒的合成与表征：通过二硫键将RIGA-miR-21共价连接到右旋糖酐包被的超顺磁性氧化铁纳米颗粒（TTX）上，并对其粒径、分散度和载药量进行表征。2）体外功能验证：利用HEK-Lucia? RIG-I报告细胞系和B16-F10黑色素瘤细胞，通过RIG-I激活报告基因检测、蛋白质印迹法（Western blot）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）等技术，评估RIGA-miR-21及其纳米颗粒形式（TTX-RIGA-miR-21）在模板miRNA-21存在下激活RIG-I信号通路、诱导干扰素-β（IFN-β）、干扰素-γ诱导蛋白10（IP-10/CXCL10）表达以及激活Caspase-3/7（细胞凋亡的关键执行者）的能力。3）体内成像与疗效评估：在荷瘤小鼠模型中，通过静脉注射Cy5.5荧光标记的TTX纳米颗粒，采用荧光活体成像和磁共振成像技术，无创地示踪和验证纳米颗粒在肿瘤部位的递送与富集。随后开展治疗研究，通过系统注射TTX-RIGA-miR-21，观察其对原发性肿瘤生长的抑制效果，并通过在治疗后期在对侧植入肿瘤细胞（再攻击实验）来评估其诱导的全身性抗肿瘤免疫记忆效应。
研究结果部分，通过一系列严谨的实验，有力地证实了该策略的有效性：
1. 模板特异性RIG-I激动剂在报告细胞系中以模板依赖性方式激动RIG-I并在黑色素瘤细胞中诱导凋亡
研究人员首先在HEK-Lucia? RIG-I报告细胞系中验证了原理。当提供外源miRNA-21模拟物（mimic）作为模板时，RIGA-miR-21能够浓度依赖性地显著激活RIG-I报告基因活性，而缺乏5’-ppp修饰的反义寡核苷酸（anti-miR-21 ASO）则无此效果，证明了其激活严格依赖于模板和5’-ppp结构。在B16-F10黑色素瘤细胞中，RIGA-miR-21（在miRNA-21模拟物存在下）能显著上调RIG-I蛋白表达、诱导下游标志物IP-10/CXCL10的分泌、激活Caspase-3/7并导致细胞活力下降。同时，它还促进了核因子κB（NF-κB）p65亚基的磷酸化，这是RIG-I信号通路激活的关键步骤。这些结果初步证明了模板依赖性RIG-I激活的可行性。
2. 纳米颗粒形式的RIGA-miR-21（TTX-RIGA-miR-21）在报告细胞系中激动RIG-I并在黑色素瘤细胞中诱导凋亡
将RIGA-miR-21与TTX纳米颗粒结合后，其功能得以保留。TTX-RIGA-miR-21在miRNA-21模拟物存在下，同样能在报告细胞系中特异性激活RIG-I。在B16-F10细胞中，它能显著上调RIG-I、IFN-β和IP-10的mRNA和蛋白表达水平，并有效诱导Caspase-3/7激活、上调肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）表达，并降低细胞活力。这表明纳米颗粒化并未影响激动剂的生物活性，反而为其体内应用提供了可能。
3. TTX-RIGA-miR-21在B16-F10黑色素瘤模型中的治疗研究
这是研究的核心体内验证部分。首先，通过体内成像证实了Cy5.5标记的TTX纳米颗粒能成功递送至肿瘤部位。磁共振成像显示，注射后24小时肿瘤区域的T2弛豫时间显著下降，荧光成像和离体*显微镜也证实了纳米颗粒在肿瘤中的蓄积。在治疗实验中，从肿瘤植入后第4天开始，连续7天静脉注射TTX-RIGA-miR-21。结果显示，与PBS对照组相比，TTX-RIGA-miR-21治疗显著抑制了原发性肿瘤的生长，且该效应在停止治疗后仍持续了一段时间。更引人注目的是“远端效应”：在第15天于小鼠对侧皮下再次植入B16-F10细胞（再攻击）后，TTX-RIGA-miR-21治疗组小鼠的二次肿瘤生长被显著抑制，而PBS组和瘤内注射传统5’-ppp-dsRNA激动剂组的二次肿瘤则迅速生长。这强烈表明系统给药的TTX-RIGA-miR-21诱导了全身性的抗肿瘤免疫记忆。此外，在TTX-RIGA-miR-21治疗组小鼠的原发和二次肿瘤中，均检测到IFN-β表达的显著上调，这与免疫激活的机制相符。
结论与讨论部分对该研究的成果与意义进行了总结与展望。本研究成功开发并验证了一种创新的、基于模板导向的RIG-I靶向激活策略。该策略的核心优势在于其高度特异性：通过利用肿瘤细胞中过表达的miRNA-21作为内源性模板，仅在目标细胞内原位组装成有活性的RIG-I激动剂，从而最大限度地减少了因RIG-I在全身广泛表达而可能导致的脱靶毒性和非特异性免疫激活。同时，研究采用的TTX纳米颗粒递送平台，不仅解决了寡核苷酸体内递送的稳定性、靶向性和胞内释放难题，其固有的磁性特性还为实现影像引导下的精准治疗提供了可能，增加了临床转化的实用价值。
在黑色素瘤模型中的实验证明，系统给药的TTX-RIGA-miR-21能有效抑制肿瘤生长，并诱导出强大的“远端效应”和免疫记忆，其效果甚至优于局部给药的傳統激动剂。值得注意的是，尽管在体外实验中需要添加外源miRNA-21模拟物才能观察到显著效果，但在体内实验中，无需额外补充模板，TTX-RIGA-miR-21便能有效激活RIG-I通路。这可能是因为纳米颗粒延长了激动剂的半衰期，使得初始的低水平激活足以诱导IFN-β的产生，而IFN-β本身又能正反馈上调miRNA-21的表达，从而形成一个自我强化的激活循环。
综上所述，这项研究将肿瘤特异性靶向、可控的免疫激活与影像引导相结合，为克服当前RIG-I激动剂疗法面临的瓶颈提供了全新的解决方案。它不仅有望与现有的CAR-T细胞、PD-1/PD-L1抗体等免疫疗法形成互补，更代表着在实现肿瘤选择性先天免疫激活方面迈出的关键一步。由于TTX平台相关制剂已进入临床试验阶段，这项研究的临床转化前景被寄予厚望。未来，该策略可以扩展到其他富含特定miRNA的癌症类型（如三阴性乳腺癌、胰腺导管腺癌、胶质母细胞瘤等），为攻克更多“免疫冷”肿瘤带来新的希望。
