《JACC: CardioOncology》：CRISPR/Cas9 Screens Implicate RARA and SPNS1 in Doxorubicin Cardiotoxicity
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本研究针对癌症治疗常用药多柔比星(DOX)存在的心脏毒性问题，通过在全基因组及靶向CRISPR/Cas9筛选体系中，使用永生化心肌细胞和诱导多能干细胞来源的心肌细胞(iCMs)，系统性鉴定DOX心脏毒性的遗传调控因子。研究发现，敲除视黄酸受体α基因(RARA)会增加DOX诱导的细胞死亡，而其激动剂他米巴罗汀(TBT)可减轻毒性；RNA-Seq表明DOX广泛抑制代谢与线粒体基因表达，而TBT能缓解此效应。另一项筛选发现，溶酶体稳态破坏（以SPNS1缺失为例）导致DOX过度积累、自噬抑制、DNA损伤增加和细胞死亡加剧。相反，核糖体功能丧失和营养剥夺可显著减少DOX积累和毒性。该研究为理解DOX心脏毒性的分子机制、发现潜在治疗靶点与遗传生物标志物提供了重要线索。
多柔比星（Doxorubicin， DOX）等蒽环类药物是临床上广泛使用的关键抗癌药物，尤其在儿童癌症和乳腺癌的治疗中功不可没。然而，其临床应用常被一种严重的副作用所掣肘——心脏毒性，这可能导致患者出现心力衰竭，影响长期生存质量。尽管医学界对此问题关注已久，但驱动DOX心脏毒性的具体分子机制和遗传因素仍然如同一团迷雾，限制了有效预防和治疗策略的开发。传统的个案研究虽然发现了一些线索，但缺乏系统性、无偏见的全景式探索。为此，一支研究团队决心采用前沿的功能基因组学方法，像在全宇宙中搜寻特定恒星一样，在心肌细胞的基因海洋中，系统性地捕捞那些能“加重”或“减轻”DOX毒性的关键基因，以期照亮这片未知的黑暗区域，并为未来的精准医疗铺路。他们的研究成果发表在《JACC: CardioOncology》上。
本研究主要运用了几项关键技术：1) 全基因组及靶向CRISPR/Cas9基因敲除筛选：在表达Cas9的永生化小鼠心肌细胞系(HL-1)、人心肌细胞系(AC16)以及诱导多能干细胞(iPSC)来源的心肌细胞(iCMs)中，使用GeCKOv2、Brunello等CRISPR文库进行大规模遗传筛选，以鉴定调控DOX介导的细胞死亡或DOX积累的基因。2) 流式细胞术与图像细胞术：用于定量分析细胞内的DOX积累水平，并基于荧光强度进行细胞分选（如将细胞分为高DOX积累群和低DOX积累群）。3) RNA测序(RNA-Seq)：分析不同处理条件下（如DMSO对照、DOX处理、DOX加他米巴罗汀处理）iCMs的全局转录组变化。4) 细胞活力测定：使用alamarBlue等试剂评估DOX对不同基因敲除细胞系的毒性作用。5) 荧光显微成像：包括共聚焦显微镜时间序列成像，用于观察DOX在细胞内的实时积累与亚细胞定位，以及免疫荧光技术分析细胞结构（如肌原纤维）和自噬标记物（如LC3）的变化。
研究结果
1. 全基因组CRISPR/Cas9筛选提名DOX介导细胞死亡的修饰因子
研究人员首先在表达Cas9的小鼠心肌细胞系HL-1中进行了全基因组CRISPR/Cas9敲除筛选。细胞用GeCKOv2文库转导后，用DOX或DMSO（对照）处理，通过下一代测序分析存活细胞中单导向RNA(sgRNA)的丰度变化。筛选鉴定出213个富集的sgRNA（靶向36个基因）和506个耗竭的sgRNA（靶向87个基因）。其中，敲除DOX的主要作用靶点基因Top2A是最强的脱敏（即降低毒性敏感性）扰动，而敲除已知的DOX外排转运蛋白基因Abcb1b则是最强的致敏（即增加毒性敏感性）扰动。基因本体(GO)术语分析显示，差异富集的通路与DNA损伤应答和程序性细胞死亡等相关。随后在人心肌细胞系AC16中进行的类似筛选也得到了可比的结果，确认了多个调控DOX毒性的基因。
2. 靶向CRISPR/Cas9筛选以鉴定生理相关的修饰基因
为了在更接近生理状态的心肌细胞中验证前期筛选结果，研究团队设计了一个靶向CRISPR/Cas9敲除验证文库，包含约7，800个sgRNA，靶向952个从HL-1和AC16筛选中脱颖而出的基因。将该文库转导至人iPSC系(SV20)后，将其分化为iCMs，并进行DOX或DMSO处理。分析显示，靶向RARA基因的sgRNAs在DOX处理组中显著耗竭，表明RARA功能丧失会增加细胞对DOX的敏感性。
3. RARA状态决定心肌细胞对DOX的敏感性
为了确认RARA的作用，研究者在另一个iPSC系(hB53)中利用CRISPR技术敲除了RARA基因。与筛选结果一致，RARA敲除的iCMs对DOX的敏感性显著高于同基因型的对照细胞。反之，使用RARA激动剂他米巴罗汀(Tamibarotene, TBT)进行预处理，则可以显著保护野生型iCMs免受DOX毒性侵害，并减轻DOX引起的肌原纤维结构紊乱。RNA-Seq分析进一步揭示，DOX处理会广泛抑制线粒体相关基因的表达，而TBT与DOX共同处理则能缓解这种抑制，提示TBT可能通过缓冲DOX对线粒体基因表达的抑制作用来提供保护。
4. 发现调控DOX积累的遗传修饰因子
除了细胞死亡，DOX在心肌细胞内的摄取和滞留是另一种关键的毒性机制。研究者在AC16细胞中进行了另一项全基因组CRISPR筛选，旨在发现调控DOX积累的因子。细胞用DOX孵育后，通过流式细胞术分选出DOX积累量高（前15%）和低（后15%）的细胞群体。分析发现，在DOX高积累组中，多个与内体/溶酶体功能相关的基因发生富集，其中ABCC1（一个已知的DOX外排转运蛋白）和SPNS1（SPNS溶脂质转运蛋白1）位列前茅。SPNS1编码一种溶酶体蛋白，参与自噬性溶酶体重构，此前未被认为与DOX处置相关。
5. 验证SPNS1作为DOX积累的修饰因子
验证实验表明，SPNS1敲除的AC16细胞比野生型细胞积累了显著更多的DOX。实时共聚焦显微镜观察发现，在SPNS1敲除细胞中，DOX更快地积累并更多地定位于核周体（推测为溶酶体），这与溶酶体探针LysoTracker Green的共定位结果一致。此外，SPNS1缺失还导致自噬流受损，表现为微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3)斑点的增加。在iPSC来源的iCMs中敲除SPNS1也得到了类似结果：DOX积累增加、形成更多更大的点状核周沉积物、LC3-II（脂化的LC3）水平升高，并且细胞在DOX暴露后的存活率更低。有趣的是，使用雷帕霉素或Torin 1化学诱导自噬，对野生型iCMs的DOX积累没有明显影响，但却进一步增加了SPNS1敲除iCMs的DOX积累，提示DOX的摄取和排出依赖于自噬-溶酶体通路的功能通量。
6. 核糖体功能丧失和营养剥夺减少DOX积累
对筛选数据的再分析发现，参与核糖体生物合成和功能的基因发生缺失，与DOX积累减少和细胞存活率增加显著相关。这提示减缓合成代谢过程可能通过直接减慢摄取或间接激活保护性通路来对抗DOX毒性。与此观点一致，实验发现，将iCMs置于营养耗竭的培养基中，可以显著降低DOX的积累和随之而来的细胞死亡，而这种效应在重新补充营养后是可逆的。
研究结论与讨论
本研究通过大规模、无偏见的CRISPR/Cas9功能基因组筛选，系统性地探索了多柔比星(DOX)诱导心脏毒性的遗传基础，发现了超过270个药物-基因相互作用。其中，视黄酸受体α(RARA) 和SPNS溶脂质转运蛋白1(SPNS1) 被确定为两个关键的新调控因子。
研究证实，RARA的功能丧失会加剧DOX毒性，而药物激活RARA（使用他米巴罗汀， TBT）则能起到保护作用。转录组分析表明，这种保护可能与缓解DOX对线粒体基因表达的广泛抑制有关，尽管其确切的因果机制仍需进一步探究。近期另有研究指出RARG基因的变异也与DOX心脏毒性相关，未来或可探索同时激活RARA和RARG是否能提供更强的保护。
另一方面，研究揭示了溶酶体稳态在DOX处置中的核心作用。SPNS1的缺失破坏了自噬-溶酶体通路，导致DOX在溶酶体中异常积累、自噬抑制、DNA损伤（表现为H2AX磷酸化增加）并最终加剧细胞死亡。这表明，减少净溶酶体含量或增强其周转可能成为减轻DOX心脏毒性的潜在策略。此外，核糖体功能相关基因的缺失以及营养剥夺能减少DOX积累和毒性，为通过调节细胞代谢状态来干预毒性提供了新思路。
当然，研究也存在局限性，例如细胞模型可能无法完全模拟体内生理环境，并且一些已知的关联（如Top2B）未在筛选中被重新发现。未来需要在动物模型中进行体内验证，并探索这些基因中的常见遗传变异如何影响患者的DOX毒性风险。
总之，这项研究不仅揭示了DOX心脏毒性背后此前未知的关键分子路径（如RARA信号和SPNS1介导的溶酶体功能），为开发新的心脏保护疗法（如RARA激动剂）或利用营养干预策略提供了理论基础，更重要的是，它建立了一个强大的功能基因组学筛选框架。该框架具有持续发掘新机制、定义新治疗切入点以及发现遗传风险因素的潜力，有望推动针对蒽环类药物心脏毒性的精准医学发展。
