《Plant Biotechnology Journal》：The Structure of Carboxyl Methyltransferase Provides Insights Into the Substrate Specificity and Divergent Evolution of Iridoid
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该研究通过解析栀子（Gardenia jasminoides）羧基甲基转移酶（GAMT）与底物（geniposidic acid）及产物（SAH）的复合物晶体结构，揭示了其与长春花（Catharanthus roseus）LAMT底物特异性（loganic acid）差异的关键分子决定因素（Phe311/Phe315）。同时发现相关细胞色素P450（CYP72A）功能分化导致开环活性丧失，共同驱动了闭环环烯醚萜苷（carbocyclic iridoids）与开环环烯醚萜苷（secoiridoids）的生物合成路径进化，为理解植物次级代谢多样性及理性酶工程提供了框架。
文章内容归纳
1 引言
环烯醚萜是一类重要的植物特化代谢产物，包括闭环形式的环烯醚萜（如京尼平苷，geniposide）和开环形式的开环环烯醚萜（如马钱子苷，loganin）。这两种代谢路径在早期即发生分化，其关键区别在于由底物特异性羧基甲基转移酶催化的决定性甲基化步骤：分别由栀子（G. jasminoides）的GjGAMT和长春花（C. roseus）的CrLAMT催化。然而，导致它们严格底物特异性及进化关系的分子决定因素尚不清楚。细胞色素P450（CYP）家族，尤其是CYP72A亚家族，在开环环烯醚萜路径中催化C-C键的断裂（如secologanin合成酶，SLS），而在栀子中存在的类似CYP72A酶的功能也存疑。本研究旨在通过结构生物学、系统发育分析和生化实验，揭示控制羧基甲基转移酶底物特异性的结构机制，以及CYP72A酶功能分化在环烯醚萜路径进化中的作用。
2 结果
2.1 栀子中京尼平酸与京尼平苷的高表达
对栀子不同组织部位的分析显示，京尼平苷、京尼平苷元（genipin）和京尼平苷-1-β-龙胆二糖苷在果实中含量最高，而京尼平酸（geniposidic acid）在上部叶片中高度积累。山栀子苷（shanzhiside）和山栀子苷甲酯（shanzhiside methylester）等也在不同组织中特异性分布。
2.2 GjGAMT与LAMTs具有共同祖先节点且对京尼平酸表现出严格底物特异性
系统发育分析表明，GjGAMT与多种LAMTs位于同一簇，拥有共同祖先节点，但形成独立的分支，这提示它们从共同祖先演化而来，分别催化京尼平苷和马钱子苷（loganin）的生物合成。生化实验证实，GjGAMT仅高效催化其生理底物京尼平酸，对马钱子酸（loganic acid）无活性；CrLAMT则相反。两者对其他小分子羧酸或多种糖苷化环烯醚萜类似物均无活性，显示出高度的底物专一性。
2.3 形成功能性同源二聚体的不对称结构
解析了GjGAMT与底物京尼平酸及辅因子产物S-腺苷高半胱氨酸（SAH）复合物的1.96 ?分辨率晶体结构。GjGAMT形成不对称的同源二聚体：其中一个单体活性位点同时结合了SAH和京尼平酸，而另一个单体仅结合了SAH，其底物结合口袋空置，暗示了GjGAMT可能采用“半位点”催化机制。该结构包含一个SAM结合域和一个用于底物结合的α螺旋帽状结构域。
2.4 赋予底物特异性关键残基的生化鉴定
通过结构比对，识别出GjGAMT（Phe311和Phe315）与CrLAMT（Val317和Met321）活性口袋中的关键差异残基。在GjGAMT中引入F311V/F315M双突变，使其获得了催化马钱子酸的活性，同时保留了其天然的京尼平酸催化活性。酶动力学分析证实了该突变体的双重底物催化效率。相反，在CrLAMT中引入相应的V317F/M321F等突变则会削弱或改变其底物偏好。研究表明，Phe311和Phe315通过空间位阻效应协同作用，阻止马钱子酸进入GjGAMT的活性位点，从而决定了其底物特异性。
2.5 CYP72As的功能分化促进了闭环与开环环烯醚萜的分化
从栀子中克隆了四个CYP72A样基因（GjP450-1至-4）。系统发育分析显示它们与已知的SLS等关系较近。然而，在烟草瞬时表达体系中，这四个GjP450均不能催化马钱子苷或京尼平苷的C-C键断裂反应。作为阳性对照，来自长春花的CrSLS1（CrCYP72A1）能有效催化马钱子苷生成开环的secologanin并进一步氧化为secoxyloganin，但不能催化京尼平苷的开环反应。这表明，在栀子中，CYP72A类酶的开环活性已经丧失，这与其闭环环烯醚萜苷（如京尼平苷）的积累相符，共同驱动了与长春花开环环烯醚萜路径的功能分化。
3 讨论
本研究表明，环烯醚萜与开环环烯醚萜的进化轨迹可能依赖于羧基甲基转移酶和细胞色素P450亚家族CYP72As的功能分化。GAMT/LAMT严格的底物特异性以及CYP72As开环活性的丧失/保留共同驱动了远缘物种中两条路径的趋异进化。结构导向的突变实验证明，仅需少数关键氨基酸的替换（如GjGAMT的F311V/F315M）即可改变酶的底物特异性，支持它们源于共同祖先的假说。研究提出了环烯醚萜生物合成路径的新分类框架：将马钱子酸路径定义为Ia路线，而京尼平酸/京尼平苷路径定义为Ib路线，它们共享共同的上游中间体（如nepetalactol），与另一条产生aucubin和catalpol的路线II（基于顺-顺式nepetalactol）区分开来。总之，这些甲基转移酶和CYP450的催化可塑性共同促成了高等植物化学多样性的进化。
4 材料与方法
包括植物材料与化合物标准品的获取、候选基因的鉴定与克隆、系统发育分析、GjGAMT及其变体的表达与纯化、酶活测定与稳态动力学分析、晶体培养与结构解析、定点突变与相对活性测定、烟草瞬时表达以及代谢物HPLC分析等详细实验流程。本研究的结构坐标已存入蛋白质数据库（PDB code: 8WWQ）。
