《Plant Biotechnology Journal》：The miR171a-TaSCL6-1 Module Acts Downstream of miR164-Targeted TaNAC21/22 to Regulate Leaf Rust Resistance in Wheat
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本研究深入解析了小麦响应叶锈菌（Puccinia triticina）侵染的分子机制，首次阐明了miR171a-TaSCL6-1这一关键调控模块如何通过抑制下游防御相关基因（TaPOD2、TaPOD35、TaERF114）的表达，从而负调控小麦对叶锈病的抗性。更为重要的是，研究揭示了位于该模块上游的miR164-TaNAC21/22通路如何通过激活MIR171a的转录来协调整个抗病应答。这一发现不仅揭示了microRNA（miRNA）与转录因子在小麦与病原菌互作中的复杂调控网络，也为通过分子设计育种（如靶向沉默miR171a或过表达TaSCL6-1）培育兼具高产与高抗病性的小麦新品种提供了关键的理论基础和极具潜力的遗传改良靶点。
1 引言
小麦作为全球三大主要粮食作物之一，其生产受到叶锈病的严重威胁。由叶锈菌（Puccinia triticina, Pt）引起的叶锈病在流行年份可导致高达40%的产量损失。因此，挖掘抗病基因、培育抗病品种是控制该病害最可持续有效的策略。MicroRNAs (miRNAs)是一类内源性的小非编码RNA，在植物生长、发育和胁迫响应中扮演着关键调控角色。然而，miRNAs在小麦叶锈病抗性中的作用机制尚不清晰。本研究旨在探索响应叶锈病的miRNAs，并解析其调控网络。
2.1 tae-miR171a的表达响应Pt侵染
为了鉴定响应叶锈病的miRNAs，研究人员对感病小麦品种Fielder接种Pt小种THT后0小时和12小时的幼苗叶片进行了小RNA测序。通过生物信息学分析，在测序数据中鉴定出112个已知的小麦miRNAs和2个新miRNAs。在接种后表达量变化超过50%的差异表达miRNAs中，tae-miR171a在接种后显著上调表达。RT-qPCR分析进一步证实，在Pt侵染的不同阶段，tae-miR171a的表达在12小时达到峰值，约为0小时时的3倍，这与小RNA测序结果一致。组织特异性表达分析表明，tae-miR171a在多个组织中组成型表达。这些结果表明，tae-miR171a可能在小麦对叶锈菌的免疫应答中发挥作用。
2.2 miR171a负向调控小麦对叶锈病的抗性
为了探究miR171a在小麦叶锈病抗性中的作用，研究团队在六倍体小麦品种Fielder中构建了miR171a过表达（miR171a-OE）和短串联靶标模拟（STTM）介导的沉默（miR171a-STTM）株系。表型分析发现，接种THT后，与野生型（WT）对照相比，miR171a-OE植株在幼苗期12天（dpi）时产生了更多的夏孢子堆，而miR171a-STTM植株的夏孢子堆则更少。显微分析进一步显示，在接种后24和48小时，miR171a-OE植株中过氧化氢（H2O2）的积累减少，而在144小时，其菌丝长度和密度增加。这些结果表明，miR171a增强了小麦幼苗对叶锈病的感性，而抑制miR171a则通过增加活性氧（ROS）积累和限制病原菌生长来促进抗性。
2.3 miR171a靶向小麦中的TaSCL6-1
为了阐明miR171a调控叶锈病抗性的机制，研究人员通过生物信息学预测和降解组测序，确认TaSCL6-1是miR171a的主要靶基因。5' RACE实验检测到了miR171a介导的TaSCL6-1 mRNA切割产物。此外，在miR171a-OE株系中，TaSCL6-1的表达显著降低，而在miR171a-STTM株系中其表达升高，这表明miR171a负向调控TaSCL6-1的表达。转录组数据分析显示，在Pt侵染后24小时，TaSCL6-1同源基因的表达水平下降最为显著。RT-qPCR分析进一步证实，TaSCL6-1同源基因的表达在侵染后18至72小时显著下调，这与miR171a的表达呈负相关。这些结果共同证实了TaSCL6-1是miR171a响应叶锈病的主要靶标。
2.4 TaSCL6-1正向调控小麦叶锈病抗性
亚细胞定位分析表明TaSCL6-A1主要定位于细胞核。作为GRAS转录因子家族成员，所有TaSCL6-1同源基因（A1, B1, D1）均具有转录激活活性。为了探究TaSCL6-1在小麦叶锈病抗性中的作用，研究团队构建了TaSCL6-A1过表达（TaSCL6-OE）和TaSCL6-1敲除（TaSCL6-KO）的小麦株系。接种THT后，TaSCL6-OE植株在幼苗期12 dpi时显示的夏孢子堆少于WT植株，而TaSCL6-KO植株则显示出更多的夏孢子堆。显微分析揭示，在接种后24和48小时，TaSCL6-OE植株中H2O2积累增加，并且在144小时菌丝长度和密度降低，而TaSCL6-KO植株则表现出相反的趋势。这些结果表明TaSCL6-1正向调控小麦对叶锈病的抗性。
2.5 TaSCL6-1促进小麦防御相关基因的表达
为了研究TaSCL6-1调控小麦叶锈病抗性的机制，研究人员对WT和TaSCL6-OE1植株在幼苗期0和24小时接种后的叶片进行了转录组分析。基因本体（GO）分析揭示了几个与叶锈病响应相关的生物过程。此外，分子功能通路，包括过氧化物酶活性、葡聚糖内切-1,3-β-D-葡萄糖苷酶活性和几丁质酶活性显著富集。编码过氧化物酶（PODs）、几丁质酶（CHTs）、转录因子（TFs）和蛋白激酶（PKs）的防御相关基因在TaSCL6-OE1株系中与WT相比显著上调。
其中表达上调最显著的基因TaPOD2、TaPOD35和TaERF114被选作进一步研究对象。通过DNA亲和纯化测序（DAP-seq）结合基序分析，鉴定出GAA基序（GAAGAA）是TaSCL6-A1的结合基序。在这些选定基因的启动子区域内发现了多个推定的GAA或GAA样基序。电泳迁移率变动分析（EMSA）表明，His标记的TaSCL6-A1重组蛋白能够在体外特异性结合含有GAA基序的启动子序列。通过双荧光素酶报告系统在本氏烟草叶片中进行瞬时表达实验证实，共表达TaSCL6-1和荧光素酶（LUC）报告基因能使报告基因活性增加约2倍，表明TaSCL6-1激活了下游基因的转录。
为了进一步确认TaPOD2、TaPOD35和TaERF114在叶锈病抗性中的作用，研究人员利用大麦条纹花叶病毒诱导的基因沉默（BSMV-VIGS）技术在小麦幼苗叶片中敲低了这些基因的表达。与对照相比，沉默这三个基因中的任何一个都会导致夏孢子堆形成增加和对叶锈病的感性增强。研究还发现，与对照相比，沉默这三个基因后过氧化物酶（POD）活性显著降低，同时H2O2水平下降。这些发现表明，TaSCL6-1通过促进包括PODs和TFs在内的防御相关基因的表达来正向调控小麦对叶锈病的抗性。
2.6 miR164靶向的TaNAC21/22正向调控小麦中miR171a的表达
尽管miR171a负向调控小麦对叶锈病的抗性，但其表达在Pt侵染后显著上调，这提示可能存在上游转录激活因子。研究人员推测某些负调控抗病性的转录因子可能在侵染过程中激活miR171a的表达。前期研究表明，miR164靶向的TaNAC21/22可作为转录激活因子，负向调控小麦对条锈病的抗性。利用接种Pt小种THT的Fielder小麦转录组数据，研究人员鉴定出六个同源的TaNAC21/22基因显著上调。RT-qPCR分析证实，TaNAC21/22-D1的表达在12小时增加了70倍以上，与转录组结果一致，表明Pt诱导激活了这些转录因子。
NAC转录因子结合其靶基因启动子区域中的CATGTG基序。研究人员在MIR171a-4B/5A/7B的启动子区域发现了多个CATGTG基序。EMSA实验证明，重组His-TaNAC21/22-D1蛋白能够在体外结合含有CATGTG基序的启动子序列。为了进一步研究TaNAC21/22-D1对MIR171a-4B/5A/7B启动子的调控作用，研究人员在本氏烟草叶片中进行了瞬时表达实验。共表达TaNAC21/22-D1和荧光素酶报告基因能使报告基因活性增加2-3倍。为了进一步确认TaNAC21/22-D1对小麦中miR171a表达的影响，研究人员构建了TaNAC21/22-D1过表达株系。RT-qPCR分析显示，在这些过表达株系中，TaNAC21/22-D1和miR171a的表达水平呈正相关。这些结果共同表明，TaNAC21/22-D1是小麦中miR171a表达的正向调节因子。
2.7 miR164靶向的TaNAC21/22正向调控小麦对叶锈病的感性
为了研究TaNAC21/22在小麦叶锈病抗性中的作用，研究人员选择了三个独立的TaNAC21/22-D1过表达株系进行表型评估。与WT对照相比，TaNAC21/22-D1过表达植株在幼苗期12 dpi时显示出更多的夏孢子堆形成和对叶锈病的感性增强。显微分析显示，在接种后24和48小时，TaNAC21/22-D1过表达植株中H2O2积累减少，并且在144小时菌丝长度和密度增加。这些结果表明TaNAC21/22-D1负向调控小麦对叶锈病的抗性。
在miR164的预测靶基因中，基于降解组测序数据，研究人员确认了多个TaNAC21/22同源基因是miR164的靶标。RT-qPCR分析显示，miR164的表达在12小时降至对照水平的约50%，与升高的TaNAC21/22表达呈负相关。为了进一步阐明它们在叶锈病抗性中的功能，研究人员使用BSMV-VIGS沉默了TaNAC21/22并瞬时过表达了miR164。两种处理都导致与对照相比夏孢子堆更少、感染面积更小，这表明miR164增强了小麦对Pt的抗性，而TaNAC21/22则抑制了这种抗性。
2.8 下调miR171a表达对小麦产量性状无负面影响
由于增强抗病性常因抗性-产量权衡而导致作物减产，研究人员评估了调控miR171a表达对小麦产量相关性状的影响。WT、miR171a-OE和miR171a-STTM株系在中国农业科学院试验田的自然条件下种植。与WT相比，miR171a-OE株系表现出株高降低以及产量相关性状（包括分蘖数、每穗粒数和千粒重）显著下降。相反，沉默miR171a不仅增强了幼苗抗性，还维持或改善了产量构成因素，例如增加了分蘖数。因此，下调miR171a可在不损害产量的情况下增强小麦对叶锈病的抗性。
3 讨论
3.1 miR171a-TaSCL6-1模块调控小麦叶锈病抗性
植物miRNAs是参与多种生物过程的关键调控分子。小RNA测序揭示，miR171a受Pt侵染诱导，并在不同发育阶段和组织中组成型表达。转基因小麦株系的功能分析证明，miR171a负向调控叶锈病抗性。降解组测序和5' RACE证实TaSCL6-1是小麦中miR171a的主要靶基因。与miR171a-STTM株系类似，过表达TaSCL6-1导致叶锈病抗性增强。因此，miR171a-TaSCL6-1模块是小麦叶锈病抗性的关键调控因子。
3.2 TaSCL6-1通过激活防御相关基因表达增强小麦叶锈病抗性
对WT和TaSCL6-OE1株系的比较转录组分析鉴定出大量差异表达的下游基因，其中与H2O2、多糖和几丁质分解代谢相关的过程显著富集。过氧化物酶（PODs）是植物中关键的氧化还原酶，通过催化各种氧化反应在胁迫防御中发挥核心作用。此外，多个编码转录因子的基因在TaSCL6-OE1株系中与WT相比显著上调，包括TaERF114。因此，上调的PODs（TaPOD2和TaPOD35）和TFs（TaERF114）很可能是TaSCL6-1的关键下游基因，共同贡献于小麦叶锈病抗性。
3.3 miR171a与miR164之间的串扰调节小麦叶锈病抗性
先前研究表明，miR171与其他miRNAs及其靶标形成复杂的调控网络。本研究进一步证明，miR164靶向的TaNAC21/22结合到MIR171a的启动子区域，激活其转录，从而增加小麦对叶锈病的感性。因此，miR164-TaNAC21/22模块很可能位于miR171a-TaSCL6-1模块的上游，共同调控叶锈病抗性。
基于研究结果，研究人员提出了一个关于miR171a-TaSCL6-1调控模块在小麦叶锈病抗性中作用的工作模型。Pt侵染后，miR164表达下降，减少了对TaNAC21/22的抑制。TaNAC21/22积累的增加增强了其与MIR171a启动子的结合并激活其转录。miR171a水平的升高随后抑制了其靶基因TaSCL6-1的转录。这种抑制减弱了下游抗病相关基因（包括TaPOD2、TaPOD35和TaERF114）的转录激活，最终导致ROS产生减少和小麦对叶锈病的感性增加。这一发现揭示了一个涉及miR164-TaNAC21/22和miR171a-TaSCL6-1模块的相互作用网络，共同调节小麦叶锈病抗性。
3.4 精细调控miR171a表达有望在不牺牲产量的前提下增强叶锈病抗性
提高作物抗病性同时保持或提高产量是农业面临的主要挑战。本研究发现，miR171a过表达株系表现出幼苗对叶锈病抗性降低，并且在田间条件下产量相关性状严重受损。相反，下调miR171a不仅改善了幼苗抗性，还维持甚至增强了产量构成因素，例如增加了分蘖能力。这些结果凸显了沉默miR171a对于抗病性和产量潜力的双重益处。未来，可以通过基因编辑敲除或沉默miR171a，或通过标记辅助选择miR171a表达较低的自然等位基因变异来增强抗病性。这些策略将有助于开发兼具强大叶锈病抗性和高产的新的小麦种质。
