《Journal of Advanced Research》：Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L orchestrates alternative splicing critical for primordial follicle formation
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本研究探讨了可变剪接（AS）在原始卵泡形成中的动态调控及其失调如何导致卵巢早衰（POI）。通过多组学分析，研究人员揭示了在胚胎发育关键窗口期（E16.5–E18.5）存在广泛的剪接重编程，并筛选出异质核核糖核蛋白L（hnRNPL）作为核心调控因子。研究人员构建了生殖细胞特异性Hnrnpl条件敲除小鼠模型，发现其缺失会导致雌性不育、原始卵泡形成减少和POI，伴随同源染色体联会缺陷和DNA双链断裂（DSBs）修复失败。机制研究表明，hnRNPL通过与剪接因子PTBP1和SRSF10互作，调控减数分裂关键基因（如Hormad1和Zcwpw1）的剪接。这项工作首次确立了hnRNPL介导的剪接程序在减数分裂前期的关键作用，并提名hnRNPL为潜在的POI生物标志物。
女性的生育能力与其出生时卵巢中储备的原始卵泡数量和质量密切相关。原始卵泡库的建立是一个复杂的过程，涉及原始生殖细胞（PGCs）经过一系列精密调控的步骤，进入减数分裂前期的联会、重组等，最终形成静止的原始卵泡。这个过程中，任何环节的失误都可能导致卵泡储备不足或功能障碍，进而引发卵巢早衰（Premature Ovarian Insufficiency， POI），即在40岁前出现卵巢功能衰竭。虽然转录调控在卵泡形成中的作用已有广泛研究，但转录后调控，尤其是前体信使RNA（pre-mRNA）的可变剪接（Alternative Splicing, AS）在此过程中的动态变化、关键调控因子和精确机制仍然知之甚少。可变剪接能够从一个基因产生多种不同的信使RNA（mRNA）异构体，极大地扩展了蛋白质组的多样性，对细胞命运决定和发育至关重要。然而，异常的剪接会产生有害的转录本，导致不良的表型后果。近期研究揭示，在雌性生殖细胞发育中，剪接体的异常表达或减数分裂基因的错误剪接与卵母细胞成熟缺陷有关，而一些剪接调控因子（如SRSF1、BCAS2、hnRNPH1）的敲除会导致小鼠出现POI。那么，在从PGCs到原始卵泡形成的动态转变过程中，是否存在一个关键的剪接调控程序？又是哪些关键因子在主导这一过程？这成为研究者们亟待回答的问题。
为了解答这些问题，一支来自浙江大学的研究团队（Feng-Jie Hu, Si-Yu Chen等作者）在《Journal of Advanced Research》上发表了一项研究。他们通过对小鼠卵巢发育多个时间点的单细胞RNA测序（scRNA-seq）和大体积RNA测序（bulk RNA-seq）数据进行分析，发现从E16.5到E18.5时期存在一个显著的剪接活性高峰，涉及6，766个差异剪接连接点和3，625个差异剪接基因，表明这是一个关键的剪接重编程窗口。通过筛选在此窗口期活跃的剪接调控因子，他们锁定了一个关键候选基因——异质核核糖核蛋白L（Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L, hnRNPL）。为了在体内验证hnRNPL的功能，研究人员利用Stra8-Cre构建了生殖细胞特异性的Hnrnpl条件敲除（cKO）小鼠模型。实验发现，Hnrnpl的缺失会导致雌鼠完全不育，卵巢体积缩小，原始卵泡形成显著减少，并伴随卵泡发育停滞在初级阶段，表现出典型的POI表型。深入的表型分析显示，敲除小鼠的卵母细胞在减数分裂前期存在严重的同源染色体联会缺陷（表现为联会复合体蛋白SYCP1定位异常和HORMAD1信号持续存在）以及DNA双链断裂（DSBs）修复失败（表现为γH2AX和RPA2信号增强）。在分子机制层面，研究人员通过RNA免疫沉淀测序（RIP-seq）和免疫沉淀-质谱联用（IP-MS）等技术，发现hnRNPL在卵巢中直接结合到关键减数分裂基因（如Hormad1和Zcwpw1）的RNA上，调控其剪接。更重要的是，hnRNPL与另外两个关键的剪接调控因子PTBP1和SRSF10存在直接的蛋白-蛋白相互作用，三者协同调控下游靶基因的剪接过程。这项研究不仅揭示了hnRNPL介导的可变剪接程序是原始卵泡形成和女性生育力的关键调控枢纽，也为其作为POI的潜在生物标志物和治疗靶点提供了理论依据。
研究人员开展此项研究运用了几个关键的技术方法：首先，利用公共的和自己生成的单细胞及大体积RNA测序数据集，分析了从原始生殖细胞到出生后第5天（E14.5–P5）卵巢发育过程中的可变剪接动态图谱。其次，通过CRISPR-Cas9技术构建了生殖细胞特异性Hnrnpl条件敲除小鼠模型，用于体内功能验证。再者，为了阐明分子机制，他们整合了多组学策略，包括免疫荧光、RNA测序、RNA免疫沉淀测序（RIP-seq）以及免疫沉淀-质谱联用（IP-MS），以识别hnRNPL相关的剪接体组分及其靶向的mRNA。最后，通过染色体铺片、免疫组织化学、蛋白质印迹（Western blot）和逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）等技术对表型和分子变化进行了详细验证。
研究结果
1. 从原始生殖细胞到原始卵泡形成过程中的可变剪接动态
研究人员分析了从E14.5到P5四个相邻发育阶段的卵巢scRNA-seq数据，发现E16.5–E18.5阶段的差异剪接事件（6，766个）和差异剪接基因（3，625个）最为显著，表明这是剪接重编程的主要窗口。功能富集分析显示，该时期的差异剪接基因主要与减数分裂细胞周期进程、染色体分离、同源重组等通路相关。同时，剪接相关因子（尤其是hnRNP家族成员）在此窗口期表达显著上调。
2. 异质核核糖核蛋白L在卵母细胞减数分裂前期I高表达
免疫荧光和染色体铺片分析显示，hnRNPL在卵母细胞核内高表达，并贯穿于从细线期到双线期的整个减数分裂前期I。其蛋白表达水平随着卵母细胞发育而增加，并在常染色质区域富集，提示其可能参与活跃的转录和剪接过程。免疫组化进一步显示，hnRNPL在原始卵泡的卵母细胞核中表达最高，并随着卵泡成熟和卵巢衰老而下降。
3. 卵母细胞中敲除异质核核糖核蛋白L导致雌性不育和卵巢早衰
构建的Hnrnpl条件敲除小鼠表现出完全的不育。组织学分析发现，敲除小鼠的卵巢体积更小，卵泡发育受阻：在P7时，野生型卵巢已有初级卵泡发育，而敲除小鼠的卵泡仍停滞在原始阶段；从P12开始，野生型出现次级卵泡，而敲除小鼠的卵泡发育仍停留在初级阶段。这证实hnRNPL对于原始卵泡的激活和后续发育至关重要。
4. 异质核核糖核蛋白L对原始卵泡的形成和激活至关重要
通过量化新生小鼠卵巢中的卵母细胞和卵泡，研究人员发现，与野生型相比，敲除小鼠卵巢中的卵母细胞总数减少，且大部分卵母细胞仍停留在细胞巢中，未能被颗粒细胞包裹形成原始卵泡。此外，敲除小鼠卵巢中高尔基体（标记蛋白GM130）和中心粒周围物质（标记蛋白Pericentrin）的定位和形态异常，表明Balbiani小体（生殖细胞特有的细胞器聚集体）形成缺陷。同时，减数分裂标志物SYCP3的信号减少，颗粒细胞增殖标记pH3S10阳性细胞也显著减少，说明hnRNPL缺失影响了减数分裂进程和卵泡体细胞环境。
5. 敲除异质核核糖核蛋白L导致cKO卵母细胞出现联会缺陷
对胚胎期和新生小鼠卵巢的染色体铺片分析显示，在hnRNPL敲除的卵母细胞中，联会复合体蛋白SYCP1无法正常定位到染色体上，而同源染色体配对缺陷的标记蛋白HORMAD1在粗线期卵母细胞中持续存在。这表明hnRNPL的缺失导致了同源染色体联会失败。
6. 异质核核糖核蛋白L敲除导致未修复的DNA双链断裂积累
由于联会缺陷会影响基于同源重组的DSBs修复，研究人员检测了DNA损伤标记。结果显示，在敲除小鼠的粗线期和双线期卵母细胞中，DNA损伤标记γH2AX和单链DNA结合蛋白RPA2的信号显著增强，表明存在大量未修复的DSBs，进一步证实了减数分裂进程的严重阻滞。
7. 异质核核糖核蛋白L敲除破坏原始卵泡发育必需基因的转录
RNA测序分析发现，在E18.5和P1的敲除卵巢中，大量与减数分裂、同源染色体配对和雌性配子生成相关的基因转录水平下调。蛋白质印迹和免疫荧光也证实了卵母细胞发育关键蛋白（如MVH， ZAR1， C-KIT）的表达下降。此外，敲除卵巢中自噬和凋亡信号增强，表明卵母细胞质量受损。
8. 异质核核糖核蛋白L调控生殖细胞发育关键基因的剪接
RNA-seq分析鉴定出敲除卵巢中存在大量异常的可变剪接事件，其中外显子跳跃（SE）是最主要类型。通过整合RIP-seq数据，研究人员发现hnRNPL直接结合到关键减数分裂基因Hormad1和Zcwpw1的RNA上，并调控其剪接。RNA下拉和RIP-qPCR实验验证了hnRNPL与这些靶RNA的直接相互作用。hnRNPL的缺失导致ZCWPW1蛋白水平显著下降。
9. 异质核核糖核蛋白L与RNA剪接因子PTBP1和SRSF10相互作用
IP-MS实验鉴定出319个与hnRNPL相互作用的蛋白，其中65个与mRNA剪接相关，包括PTBP1和SRSF10。通过构建截短体和免疫共沉淀（co-IP）实验，研究人员确定了hnRNPL与PTBP1、SRSF10相互作用的关键结构域。分子对接预测进一步支持了这些相互作用。免疫荧光和RIP-qPCR实验证实了它们在体内的共定位及对共同靶基因（Hormad1， Zcwpw1）的协同调控。
结论与讨论
本研究首次系统地描绘了小鼠卵巢从原始生殖细胞到原始卵泡形成过程中的可变剪接动态图谱，并揭示了其中的核心调控因子hnRNPL。研究发现，在胚胎发育的E16.5–E18.5时期存在一个剧烈的剪接重编程高峰，这恰好与减数分裂前期的关键事件窗口重合。通过构建生殖细胞特异性敲除模型，研究证实hnRNPL对于女性生育力是必不可少的：其缺失导致原始卵泡形成和激活失败，引发卵巢早衰和不育。深入的表型分析将缺陷根源定位在减数分裂前期，表现为同源染色体联会失败和DNA双链断裂修复受损。
在机制层面，本研究阐明了hnRNPL通过调控关键减数分裂基因（如Hormad1和Zcwpw1）的可变剪接来确保减数分裂正常进行。hnRNPL并非孤立行动，而是与剪接因子PTBP1和SRSF10形成蛋白互作网络，协同调控下游靶基因的剪接程序。这一发现将剪接调控与生殖细胞发育的分子机制紧密联系起来。
这项研究的意义重大。首先，它确立了可变剪接作为调控原始卵泡形成和女性生育力的一个关键转录后调控层。其次，它将hnRNPL鉴定为一个新的、功能不可或缺的POI相关基因，为其作为潜在的POI诊断生物标志物提供了候选依据。最后，研究揭示了hnRNPL-PTBP1-SRSF10调控轴，为理解剪接因子如何在特定发育阶段精确调控基因表达提供了新范例。未来的研究可以探索该通路中其他成员的功能，评估其在人类POI患者中的变异情况，并探索靶向该通路改善卵巢功能的可能性。总之，这项工作深化了我们对女性生殖衰老分子基础的理解，并为相关生殖疾病的诊治提供了新的思路和靶点。
