《Journal of Chromatography B》：Development and validation of a HILIC–ESI/MS method for quantitation of three oxicams and 5-hydroxypiroxicam in human breast milk
编辑推荐：
本文推荐一种基于亲水相互作用色谱-电喷雾电离质谱（HILIC-ESI/MS）的新方法，用于同步定量人乳中的替诺昔康、美洛昔康、吡罗昔康及其活性代谢物5′-羟基吡罗昔康。该方法仅需25?μL样本，8分钟完成分析，定量下限达20?ng?mL?1，为临床监测哺乳期奥昔康类非甾体抗炎药（NSAIDs）的残留提供了高效、灵敏的技术支持，对保障婴儿用药安全具有重要意义。
母乳是婴儿最理想的天然食品，但同时也可能成为药物残留进入婴儿体内的途径。哺乳期母亲因产后疼痛等原因可能需要使用非甾体抗炎药（NSAIDs），其中奥昔康类药物（如替诺昔康、美洛昔康、吡罗昔康）因其长效特性，可能存在乳汁中蓄积的风险，进而影响婴儿健康。然而，由于人乳成分复杂，且现有分析方法多针对血浆或动物乳汁，缺乏能够同时、快速、准确检测人乳中多种奥昔康类药物的技术，这给临床评估哺乳期用药风险带来了挑战。为了填补这一技术空白，来自希腊雅典国立卡波迪斯特里安大学药学院药物分析实验室的研究团队，开发并验证了一种新型的亲水相互作用色谱-电喷雾电离质谱（HILIC-ESI/MS）分析方法，相关研究成果发表在《Journal of Chromatography B》上。
研究人员主要运用了亲水相互作用色谱（HILIC）分离技术与电喷雾电离质谱（ESI/MS）检测技术相结合的策略。样本处理采用简单的蛋白沉淀法，仅需25?μL人乳样本。研究队列包含十名捐赠给医院母乳库的哺乳期妇女的乳汁样本，用于方法的应用验证。
研究结果
ESI/MS优化
研究首先对质谱条件进行优化。通过直接灌注标准品溶液，比较了正负离子模式，最终选择正离子模式（ESI(+)）以获得更高的信号强度。毛细管电压设定为4.5?kV，离子源温度为240?°C，锥孔电压优化为20?V，在保证分子离子峰丰度的同时避免过度碎裂。定量采用选择离子监测（SIM）模式，监测各分析物的质子化离子[M+H]+。
色谱条件优化
研究初期尝试了反相色谱，但因需要高水相比例导致质谱灵敏度下降，故转向HILIC策略。选用ZIC-cHILIC色谱柱，通过对缓冲液类型、浓度、水相比例及pH值的单因素优化，最终确定流动相为95%乙腈和5%的14?mM甲酸铵水溶液（pH?6.8），流速0.35?mL?min?1。在此条件下，所有分析物在8分钟内实现良好分离，且避免了与基质组分的共洗脱。?1）的提取离子色谱图叠加对比，显示各峰分离良好，无基质干扰。">
样本制备优化
针对人乳中蛋白质、脂质等复杂基质，研究采用乙腈蛋白沉淀法进行前处理。通过优化样本体积、盐浓度和滤膜类型，确定了使用25?μL乳汁样本，加入5?mM甲酸铵（pH?6.1）及乙腈，涡旋离心后，上清液经疏水性聚四氟乙烯（PTFE）滤膜过滤后直接进样分析。该流程简单高效，能有效去除干扰物。
方法学验证
方法经过了全面的验证。选择性试验表明，在六份不同来源的空白人乳中，目标分析物及内标（泰妙菌素，tiamulin）的保留时间处均无干扰峰。线性范围在20至2000?ng?mL?1内良好，相关系数（r）大于0.997。定量下限（LOQ）为20?ng?mL?1，检测下限（LOD）为4?ng?mL?1。准确度（回收率）在93.9%至106.1%之间，精密度（日内与日间变异系数）均低于15%，符合国际人用药品注册技术协调会（ICH）M10指南要求。回收率在87.6%至96.1%之间，基质效应轻微，在可接受范围内（±15%）。稳定性试验表明，样本在-20?°C下可稳定储存四周，经历三次冻融循环或在室温放置4小时，浓度偏差均在±20%以内。
应用于单供体人乳样本分析
将已验证的方法应用于从十名哺乳期妇女（产后1-6个月）收集的乳汁样本进行筛查。根据捐赠者自述的用药史，无人使用奥昔康类药物。分析结果显示，所有样本中均未检测到目标分析物（低于LOQ）。尽管在本队列中未检出，但该方法具备在实际临床或监测环境中（如母乳库、药物警戒研究）进行靶向筛查的能力，其灵敏度足以检测到既往药代动力学研究中报告的相关浓度水平。
分析方法的绿色度评估
研究还运用多种计算工具评估了该HILIC-ESI/MS方法的环保性。虽然流动相中乙腈占比高达95%是主要环境顾虑，但低流速（0.35?mL?min?1）、短运行时间（8分钟）、小样本用量（25?μL）以及简单的样本前处理流程，部分抵消了溶剂消耗的影响，使该方法获得了中等的综合绿色度评分。
结论与讨论
本研究成功建立并验证了首个可同时定量人乳中替诺昔康、美洛昔康、吡罗昔康及其活性代谢物5′-羟基吡罗昔康的HILIC-ESI/MS方法。该方法具有样本用量少（25?μL）、前处理简单（蛋白沉淀）、分析速度快（8分钟）、灵敏度高（LOQ为20?ng?mL?1）以及基质效应低等显著优点。其成功应用证明了该方法能够有效处理复杂的人乳基质，适用于高通量筛查。尽管在初步的十人样本筛查中未发现奥昔康残留，但这恰好验证了方法的选择性，且其检测能力足以覆盖已知的药代动力学研究浓度，为未来大规模的临床监测和研究提供了可靠工具。这项工作填补了该领域同时分析多种奥昔康类药物的方法学空白，为更精准地评估哺乳期妇女使用此类长效NSAIDs时婴儿的药物暴露风险、制定基于证据的用药指南提供了坚实的技术基础，对保障婴幼儿健康具有重要意义。
