机械刺激与谱系分化调控间充质细胞来源胞外囊泡的促血管生成潜能

《Advanced Biology》：Mechanical Cues and Lineage Commitment Govern the Angiogenic Potential of Mesenchymal Cell-Derived Extracellular Vesicles

本综述揭示了机械刺激与细胞分化阶段如何协同调控间充质来源骨细胞（MSC/OB/OCY）分泌组及其胞外囊泡（EVs）的血管生成潜能。研究表明，机械活化的骨细胞（OCY）来源EVs在促进内皮细胞（HUVEC）迁移、成管及CD31表达方面表现最优，并在鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型中验证了其强大的促新生血管形成能力，为骨修复提供了一种新型的无细胞促血管生成纳米疗法。

　　

¹引言

骨再生需要成骨作用与血管生成之间精细协调的相互作用。当前的自体/异体移植物等治疗方法虽然能提供支撑，但常常无法促进完全修复所需的有效血管化。胞外囊泡作为细胞间通讯的介质，因其生物活性载货和低免疫原性，已成为组织再生领域前景广阔的无细胞纳米技术。机械刺激是已知的骨细胞功能增强剂，可以调控EV的载货并潜在地提高其再生效力。本研究探讨了机械刺激和间充质谱系分化阶段如何影响源自间充质基质/干细胞、成骨细胞和骨细胞的分泌组和EVs的血管生成潜能。

²材料与方法

本研究使用了人源间充质干细胞、由MSC分化而来的成骨细胞以及小鼠MLO-Y4骨细胞系。细胞在平行板流动腔生物反应器中接受振荡流体剪切应力（1 Pa， 1 Hz）2小时进行机械刺激，随后收集条件培养基和通过超速离心分离EVs。通过透射电镜、纳米颗粒跟踪分析和流式细胞术对EVs进行表征。血管生成潜能通过人脐静脉内皮细胞的成管形成实验、迁移实验、增殖实验以及免疫细胞化学（检测CD31表达）进行评估。此外，还在临床前离体鸡胚绒毛尿囊膜模型中评估了EVs的促血管生成效果。

³结果

^3.1机械刺激的MSC分泌组对HUVEC成管形成的影响

静态培养的MSC条件培养基对HUVEC的血管生成没有明显影响。然而，机械活化的MSC条件培养基处理显著增加了连接点和片段的数量，其效果与阳性对照（VEGF）相当，表明机械活化促进了MSC分泌促血管生成因子。

^3.2机械刺激的OB分泌组对HUVEC成管形成的影响

与MSC类似，静态OB条件培养基不影响血管生成。有趣的是，尽管机械活化的OB条件培养基在连接点、片段和总管长指标上略有增加，但并未引起显著的血管生成反应。这与MSC的结果形成对比，表明随着细胞沿成骨谱系分化，其分泌组的血管生成特性发生了改变。

^3.3机械刺激的OCY分泌组对HUVEC成管形成的影响

静态骨细胞条件培养基同样不影响血管生成。机械活化的骨细胞条件培养基处理显示出清晰的连接点和片段，尽管量化后与对照相比未达统计学显著性，但存在增加趋势。这些结果表明，间充质骨细胞分泌组的血管生成特性随着分化而减弱，但可通过亲代细胞的机械刺激得到增强。

^3.4间充质来源骨细胞释放的EVs在成骨谱系中表现出相似的特征

从MSC、OB和OCY条件培养基中分离的EVs均呈现典型的圆形形态，平均尺寸约为140 nm，并表达EV标志物CD63和CD81。OCY-EVs的颗粒浓度有高于MSC-EVs和OB-EVs的趋势。所有细胞类型的EV蛋白含量约为0.5 μg/mL。

^3.5MSC来源的EVs不影响血管生成

静态和机械活化的MSC-EVs均未显著影响HUVEC的成管形成。机械活化的EV耗竭培养基在各项指标上略有增加，表明MSC条件培养基的促血管生成效应可能源于可溶性因子与EVs的共同作用。

^3.6OB来源的EVs增强HUVEC的成管形成

静态OB-EVs对血管生成略有促进但不显著。相比之下，机械活化的OB-EVs显著增加了连接点和片段的数量，效果与阳性对照相当，而机械活化的EV耗竭培养基效果减弱。这突显了机械刺激对OB-EVs促血管生成效力的积极作用。

^3.7OCY来源的EVs增强HUVEC的成管形成

静态OCY-EVs不影响血管生成。然而，机械活化的OCY-EVs显示出显著的促血管生成效果，连接点、片段和总管长均显著增加，效果与VEGF对照相当。机械活化的EV耗竭培养基则显示出抑制效应，表明全条件培养基中可能含有抗血管生成的可溶性因子。机械活化的OCY-EVs是唯一能显著增加总管长的EV类型，因此被选为进一步深入研究的候选者。

^3.8OCY-EVs^MA的血管生成反应与EV剂量呈负相关

剂量反应研究表明，对于机械活化的OCY-EVs，0.5 μg/mL（相当于条件培养基中的浓度）剂量在促进连接点和片段形成方面效果最优，且变异性低于更高剂量（2和4 μg/mL）。因此，0.5 μg/mL被选为后续研究的最佳剂量。

^3.9OCY-EV^MA处理导致HUVEC迁移增加和CD31表达升高

虽然OCY-EVs不影响HUVEC增殖，但机械活化的OCY-EVs处理显著增强了内皮细胞的迁移能力。更重要的是，免疫荧光染色显示，机械活化的OCY-EVs处理显著增加了CD31（血小板内皮细胞黏附分子-1）的表达，表明其促进了更成熟血管表型的形成。

^3.10OCY-EV^MA处理在离体鸡胚模型中增加血管生成

在离体鸡胚绒毛尿囊膜模型中，机械活化的OCY-EVs处理显著增加了膜内血管的总管长，这与体外成管实验结果一致，进一步证实了其促血管生成的 therapeutic potential。

⁴讨论

本研究首次确立了成骨谱系阶段与机械刺激骨细胞来源EVs血管生成影响之间的关系。结果表明，亲代细胞的机械刺激和分化阶段均显著调节所产生EVs的血管生成特性。其中，机械活化的骨细胞来源EVs表现出最优的促血管生成效力。它们能增强内皮细胞迁移、提高CD31表达、并促进更复杂管状结构的形成，且在0.5 μg/mL的低剂量下效果最佳。在临床前离体CAM模型中也验证了其强大的促新生血管形成能力。这些发现共同突出了机械活化骨细胞来源EVs作为一种有前景的促血管生成策略，可用于骨修复治疗。本研究也存在一些局限性，例如使用了人和鼠两种来源的细胞，以及EV疗法普遍面临的规模化生产和标准化挑战。未来的工作应侧重于表征EVs内的特定载货，以深入了解其功能机制。总之，本研究首次阐明了机械刺激和亲代细胞谱系阶段对骨细胞来源分泌组及相关EVs血管生成特性的调控作用，并强调了机械活化OCY-EVs作为一种针对骨修复定制的新型血管生成疗法的潜在治疗价值。