《Journal of Controlled Release》：Formulation and administration timing of lipid derivatized JAK-inhibitor and corticosteroid modulate saRNA-LNP inflammation and expression
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本研究为解决自扩增RNA-脂质纳米粒（saRNA-LNP）疗法因强烈先天免疫激活而限制其基因表达与疗效的问题。研究人员系统评估了JAK抑制剂（peficitinib）和皮质类固醇（dexamethasone）的脂质衍生化前药，通过共包载与独立递送等不同剂型策略及给药时机，来调控炎症与表达。结果显示，共包载策略虽抑制炎症却可能损害saRNA复制与表达，而独立递送策略在数小时后延迟了相关应答，在有效减轻炎症的同时保留了saRNA的复制与表达。这一发现为优化saRNA-LNP疗法的免疫原性与治疗效果提供了精细化调控路径。
在核酸药物领域，自扩增RNA（saRNA）脂质纳米粒（LNP）递送系统被视为一项革命性进步，它能在比传统mRNA-LNP低得多的剂量下实现更持久的蛋白表达，为疫苗和蛋白替代疗法带来了巨大希望。然而，这把“双刃剑”的另一面却异常锋利：saRNA在细胞内的复制过程会产生双链RNA（dsRNA）中间体，其本身及LNP组分都会强烈激活先天免疫系统，引发剧烈的炎症反应。这种反应虽然在某些疫苗应用中能增强免疫原性，但在追求持久蛋白表达的蛋白替代治疗中，却会导致转基因表达被抑制、转染细胞被清除，严重削弱治疗效果。因此，如何“驯服”saRNA-LNP引发的炎症风暴，在不牺牲其强大表达潜力的前提下控制其反应原性，成为推动该技术走向更广阔临床应用的紧迫挑战。
传统的策略，如使用修饰核苷酸或共表达病毒免疫抑制蛋白，存在效果不足或作用延迟等问题。基于此，本研究独辟蹊径，聚焦于两种已被证实具有广泛免疫抑制效果的小分子药物：pan-JAK抑制剂培非替尼（peficitinib）和皮质类固醇地塞米松（dexamethasone）。研究的创新之处在于，不仅评估了药物本身的效果，更深入探究了如何通过精巧的“递送设计”——即将药物进行脂质衍生化制成前药，并系统比较不同的剂型策略（共包载于同一LNP vs. 独立制成不同LNP）以及不同的给药时机，来最终影响免疫调节与基因表达之间的微妙平衡。
该研究论文发表在《Journal of Controlled Release》上。为开展此项研究，作者团队运用了多项关键技术方法：利用体外转录（IVT）合成基于委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）TC-83株、编码萤火虫荧光素酶（fLuc）报告基因的saRNA；采用T型结混合器微流控技术制备各类LNP；使用动态光散射（DLS）、高效液相色谱（HPLC）、TNS荧光法、冷冻透射电镜（Cryo-TEM）等对LNP的粒径、电位、包封率、pKa和形态进行系统表征；在体外使用HeLa细胞和稳定表达NF-κB与IRF诱导型报告基因的A549-Dual?细胞系，评估免疫激活（通过SEAP和Lucia荧光素酶检测）与saRNA表达（通过fLuc检测）；在体内使用BALB/c小鼠模型，通过活体生物发光成像（IVIS）长期追踪saRNA表达，并通过Meso Scale Discovery（MSD）多重细胞因子检测和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析系统炎症水平及细胞内通路变化。
3.1. 培非替尼和地塞米松在体外限制炎症并增强蛋白表达
研究人员首先在体外验证了两种药物的效果。将saRNA与不同浓度的游离药物共转染细胞发现，两者均能有效抑制由saRNA诱导的IRF3/7和NF-κB通路激活，其中培非替尼的抑制效果更强且呈剂量依赖性。同时，两种药物都能显著增强saRNA-fLuc的表达，培非替尼的作用呈钟形曲线，在中等剂量（12.5 ng）时达到峰值，而地塞米松则表现为平台效应，无显著剂量依赖关系。这初步证实了JAK抑制剂和皮质类固醇在减轻炎症的同时提升saRNA表达的潜力。
3.2. 药物的脂质衍生化不改变其功能并提高其掺入LNPs的效率
为提高药物在LNP中的负载效率并实现靶向递送，研究人员将培非替尼和地塞米松分别与亚油酸连接，制成脂质衍生化前药。功能验证实验表明，前药保持了与母体药物相当的抑制免疫激活和增强saRNA表达的能力。关键的是，HPLC分析显示，前药在LNP中的包封率高达95%以上，而未经修饰的培非替尼药物包封率仅约30%，证明脂质化显著提升了药物在纳米制剂中的整合效率。
3.3. 将saRNA与前药共包载于LNPs中可在体外有效抑制炎症
接下来，研究人员将saRNA与不同摩尔比例（0.05%， 0.5%， 2.5%）的前药共同包载进单一LNP中。表征数据显示，前药的加入未显著改变LNP的粒径、电位、pKa等理化性质及形态。在细胞实验中，共包载的LNP确实有效抑制了IRF3/7和NF-κB的激活。然而，对于培非替尼前药，仅在最低浓度（0.05 mol%）下轻微增强了saRNA表达，更高剂量（≥0.5 mol%）反而导致表达下降，显示出免疫抑制与转基因表达之间的剂量依赖性权衡。相比之下，地塞米松前药在所有测试浓度下均能抑制炎症，且在0.5 mol%和2.5 mol%时还能显著增强saRNA表达。
3.4. 培非替尼前药共包载体降低saRNA的体内表达，而地塞米松前药共包载体则维持表达
体内实验带来了更复杂的结果。在小鼠肌肉注射模型中，即使使用最低剂量（0.025 mol%），培非替尼前药共包载LNP也会降低saRNA-fLuc的表达，且抑制效果呈剂量依赖性。相反，地塞米松前药共包载LNP在所有浓度下均未对表达产生负面影响，最高剂量组（4 mol%）甚至在后期显示出表达改善的趋势。这表明，共包载策略对两种药物的影响截然不同。
3.5. 将saRNA和前药独立包载于不同的LNPs中可在体外挽救saRNA的表达
为克服共包载培非替尼的弊端，研究团队尝试了独立制剂策略：将saRNA和前药分别包载于不同的LNP中，并在不同时间点（前、同时、后）进行转染。这一策略取得了积极效果：独立给药的培非替尼前药LNP依然能有效抑制免疫激活，并且成功挽救了saRNA的表达——在低剂量下所有时间点均能增强表达，在高剂量下，同时或后给药也能恢复或改善表达。地塞米松前药LNP则一如既往地保持兼容性。
3.6. 将saRNA和前药独立包载于不同的LNPs中可在体内有效减轻炎症同时维持saRNA表达
体内独立给药实验（腹腔注射）证实了这一策略的可行性。无论是培非替尼还是地塞米松前药LNP，在saRNA-LNP给药前后给予，都能显著降低血清中多种促炎细胞因子（如IFNβ、IL-6、IP-10等）的水平。更重要的是，独立给药策略避免了共包载时观察到的培非替尼剂量依赖性表达抑制，最高剂量组（800 ng）甚至表现出表达改善的趋势。地塞米松组则依然维持了基线表达水平。
3.7. 关于共包载体导致saRNA表达下降的机制见解
为什么共包载培非替尼会抑制表达？机制研究发现，问题不在于RNA降解。RT-qPCR检测显示，与对照组或独立给药组相比，共包载培非替尼的LNP转染细胞后，其亚基因组saRNA拷贝数在4小时到24小时间没有增加，反而下降，表明早期复制受损。进一步的转录组分析揭示，共包载引发了更早、更强的细胞内应答：内体损伤标志物LGALS8、自噬接头蛋白NDP52和SQSTM1、整合应激反应（ISR）标志物（如DDIT4）、以及RNA衰变通路成分（如DCP2、XRN1）等均被提前和上调。这表明，共包载使得saRNA和前药被同步递送至同一内体，可能加剧了内体逃逸相关的膜损伤，从而过早地触发了细胞防御和清除程序，压缩了saRNA复制酶翻译和建立复制所必需的“黄金窗口期”。而独立给药策略将前药的递送延迟了数小时，从而将这部分应激反应也相应推后，为saRNA的早期扩增赢得了时间。
该研究的结论与讨论部分深刻阐明了剂型设计的核心重要性。研究发现，JAK抑制剂（培非替尼）和皮质类固醇（地塞米松）的脂质衍生化前药能有效调控saRNA-LNP的先天免疫激活，但最终效果高度依赖于递送策略和时机。共包载策略虽能实现精准共递送、降低系统暴露，但对于培非替尼这类JAK抑制剂，却可能因同步加剧内体损伤信号和下游防御通路（如自噬、ISR、RNA衰变），而过早扼杀saRNA的复制，导致表达下降，形成了免疫抑制与基因表达之间的冲突。相比之下，地塞米松因其更广谱的作用机制和更宽的治疗窗，在共包载时表现出更好的兼容性。
独立递送策略则提供了一种优化的解决方案：通过将saRNA与免疫调节剂分别包载，并错开给药时间（尤其是后给药），可以在有效减轻全身和局部炎症反应的同时，保全甚至增强saRNA的转基因表达。这本质上是利用时间差，将免疫抑制干预的时机与saRNA复制建立的关键早期窗口进行解耦。
这项研究的重大意义在于，它超越了对单一药物效价的评估，转而强调“如何递送”与“何时递送”的决定性作用。它揭示了对saRNA这类动态复制系统而言，免疫调节干预的时机必须精确考量细胞内的级联事件时序。研究为saRNA-LNP疗法的临床转化提供了一条清晰的精细化路径：通过合理的剂型设计（独立制剂）和给药方案优化（时机控制），完全有可能在控制不良反应（反应原性）和最大化治疗效果（转基因表达）之间找到最佳平衡点，从而释放saRNA技术在长效蛋白治疗、疫苗等领域的全部潜力。
