《Journal of Controlled Release》：Lipid nanoparticle (LNP)-mediated cytoplasmic expression of single-stranded DNA and its application in Mpox vaccine
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LNP-ssDNA-T7RNAP系统通过LNP递送ssDNA模板和T7RNA聚合酶，实现细胞质内转录翻译，解决mRNA短半衰期和DNA递送效率问题，在小鼠中成功诱导mpox疫苗抗原的免疫应答。
张凯翔|刘彩霞|葛瑞杰|张卓|刘倩|莫欧阳|李轩|刘雪婷|李洪林|郝佩
华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海200237，中国
摘要
脂质纳米颗粒（LNP）递送的mRNA由于半衰期短和表达时间短暂，其治疗潜力有限；而自扩增RNA（saRNA）则面临体积大、免疫原性和制剂方面的挑战。基于DNA的系统虽然稳定性较高，但存在递送效率低、依赖细胞核以及基因组整合风险等问题。本文提出了一种新型基因递送系统LNP-ssDNA-T7RNAP的概念验证研究，该系统结合了两种技术的优势：利用LNP高效的递送能力和DNA载体的细胞质表达特性，同时降低了基因组整合的风险。该方法通过LNP同时递送单链DNA（ssDNA）模板和T7 RNA聚合酶（T7RNAP），实现完全在细胞质中的转录和翻译。通过系统优化（调整引物长度以启动T7RNAP驱动的转录、调整引物与模板的比例、对ssDNA进行5′-硫代磷酸化修饰，以及通过mRNA或DNA共同递送T7RNAP），在哺乳动物细胞中实现了稳健的基因表达。我们进一步利用该系统构建了一种含有两种抗原L1R和A33R的Mpox疫苗，单次给药即能在小鼠体内引发强烈的抗原特异性免疫反应，且未观察到组织毒性。这些结果表明LNP-ssDNA-T7RNAP系统是一种安全且多用途的基因递送策略，适用于需要持续表达的疫苗和其他治疗应用。
引言
脂质纳米颗粒（LNP）介导的信使RNA（mRNA）递送已成为一种经过临床验证并被广泛采用的基因递送方法。在COVID-19大流行期间，mRNA疫苗的成功开发进一步激发了人们对mRNA疗法的兴趣，使其在基因编辑、癌症免疫治疗、蛋白质替代疗法和再生医学等多个领域得到广泛应用[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]。LNP能够高效且可扩展地将核酸递送到细胞内，实现合成mRNA的快速细胞质翻译。此外，mRNA递送避免了基因组整合的风险，非常适合用于短暂表达的应用。尽管如此，LNP-mRNA系统的主要局限性在于其细胞内半衰期较短，由于快速降解，mRNA在转染后几小时内就能达到峰值表达，随后迅速下降，24小时内蛋白质水平显著降低[8]、[9]、[10]。这种短暂的细胞内半衰期不仅限制了治疗窗口期，还要求频繁重新给药以维持足够的蛋白质产量。在某些癌症mRNA疫苗治疗中，患者通常需要每4-7天重新注射一次mRNA药物以维持有效的免疫反应[11]、[12]、[13]。自扩增RNA（saRNA）技术通过引入来自正链 alphaviruses（如Semliki Forest病毒（SFV）、Sindbis病毒或Venezuelan equine encephalitis病毒（VEEV）的复制酶基因，延长了mRNA的持续时间[14]、[15]、[16]，这些复制酶通过细胞质复制放大RNA模板，模拟病毒的天然生命周期，从而延长并增强蛋白质的产生。然而，saRNA体积较大（例如基于VEEV骨架的COVID-19 saRNA疫苗ARCT-154全长约为9.3 kb），给高效合成、LNP封装和高质量生产带来了挑战[19]、[20]、[21]，并且其病毒起源可能引发宿主的强烈免疫反应，影响耐受性和体内效果[22]、[23]。
基于DNA的表达系统（包括慢病毒载体（LV）、腺相关病毒载体（AAV）、逆转录病毒载体或质粒DNA）在研究和临床基因治疗中得到广泛应用，表现出良好的细胞内稳定性和持久性[24]、[25]、[26]、[27]、[28]。尽管这些系统已有悠久的历史，但它们受到递送效率低、依赖细胞核进入进行转录以及基因组插入可能致癌的局限性的影响[29]、[30]、[31]。结合RNA和DNA递送系统的优势与局限性，有可能通过整合两者的互补技术实现基因治疗的重大突破。即设计一种既能利用LNP高效递送和细胞质表达特性，又能保证DNA载体长期稳定且降低基因组整合风险的基因递送系统，从而实现高效递送和持续转基因表达，同时避免传统mRNA或DNA载体的缺点。
本研究旨在开发一种模块化的基因递送系统“LNP-ssDNA-T7RNAP”，该系统利用LNP递送单链DNA（ssDNA）模板，并利用T7 RNA聚合酶（T7RNAP）在哺乳动物细胞细胞质内直接从ssDNA模板进行转录的能力。生成的转录本通过内部核糖体进入位点（IRES）进行翻译[32]。由于T7RNAP具有单亚基结构和高转录活性，基于T7RNAP的表达系统在过去三十年中一直备受关注。这项技术最初是在简单的痘苗病毒/T7杂交系统中通过使用非帽依赖性翻译概念开发的[33]、[34]，随后发展为包含mRNA加帽酶和多聚腺苷酸化机制的复杂系统[35]、[36]，并进一步拓展到光遗传学等应用领域[37]、[38]、[39]。Cho等人的最新研究展示了基于T7RNAP的DNA疫苗在体内的强大效果[40]，证明了细胞质转录作为强大疫苗策略的可行性和潜力。在所有已建立的T7RNAP系统中，DNA模板通常以双链DNA（dsDNA）形式编码或递送。dsDNA的物理化学特性（如结构刚性）可能与其在mRNA疫苗递送中的广泛应用形成障碍，因为dsDNA的分子量约为50 nm，而mRNA约为0.75 nm[43]，这给LNP的有效封装带来了挑战[44]、[45]。相比之下，ssDNA具有与mRNA相似的柔韧性和分子量特性，非常适合高效LNP包装和递送。此外，传统质粒DNA疫苗在小鼠体内会引起急性炎症反应，导致高死亡率[46]，主要是因为胞质中的dsDNA强烈激活了cGAS–STING信号通路；而ssDNA则几乎不激活该通路[47]，为细胞质基因递送提供了潜在的安全优势。因此，我们基于此开发了一种新的系统，使用ssDNA作为转录模板。在我们的概念设计中，ssDNA模板包含T7启动子、内部核糖体进入位点（IRES）和基因编码序列，并通过LNP递送到目标细胞细胞质中，由T7RNAP（以mRNA或蛋白质形式）共同递送，实现独立于细胞核进入的稳健且持续的转基因表达。生成的转录本通过IRES进行翻译。这种方法结合了LNP介导的细胞质递送效率和DNA的转录稳定性，同时规避了传统dsDNA载体的关键局限性。
在本研究中，我们建立了“LNP-ssDNA-T7RNAP”基因递送系统，并在细胞和动物模型中验证了其功能。结果显示，ssDNA模板在细胞质中被转录为mRNA，随后翻译为功能性蛋白质，可用于表达多种报告蛋白和病毒抗原。我们通过调整引物长度（启动T7RNAP驱动的转录）、调整引物与模板的比例、对5′端进行硫代磷酸化修饰，以及通过mRNA或DNA共同递送T7RNAP来优化该系统。为进一步证明其实用性，我们使用“LNP-ssDNA-T7RNAP”系统构建了含有两种抗原L1R和A33R的Mpox疫苗，并对其进行了小鼠接种实验。该疫苗在小鼠体内引发了强烈的抗原特异性免疫反应，证明了该系统作为新型基因递送平台的可行性和有效性，具有广泛的治疗应用前景。
章节摘录
哺乳动物细胞中T7RNAP的细胞质定位及T7RNAP驱动的DNA模板转录
我们设计了一种模块化基因递送系统，其核心原理是利用T7RNAP在细胞质中高保真地转录携带T7启动子的DNA模板。生成的mRNA通过IRES和模板编码的poly(A)尾实现非帽依赖性翻译（图1A）。
讨论
LNP-ssDNA-T7RNAP平台独特地结合了mRNA和DNA的递送策略。传统的mRNA-LNP疫苗使用化学稳定的mRNA，在细胞质中快速翻译，但寿命较短。这类mRNA疗法依赖核苷酸修饰和LNP封装来规避先天免疫系统的识别[85]，尽管mRNA可以绕过细胞核（避免基因组整合），但其编码的蛋白质仅能短暂产生，因为RNA会迅速降解[8]、[9]、[10]。
伦理声明
所有动物实验均遵循《实验室动物护理和使用指南》进行，并获得了中国科学院上海免疫与感染研究所动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（批准编号：A2023028）。小鼠饲养在特定无病原体（SPF）条件下，控制湿度（目标：55%，范围：45–65%）、温度（目标：22°C，范围：20–24°C），并保持12小时光照/12小时黑暗的周期。
CRediT作者贡献声明
张凯翔：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、方法学、概念设计。
刘彩霞：撰写 – 审稿与编辑、验证、资源获取、方法学、数据管理。
葛瑞杰：验证、方法学、正式分析。
张卓：验证、正式分析。
刘倩：验证、方法学、正式分析。
莫欧阳：验证、正式分析。
李轩：撰写 – 审稿与编辑、可视化、监督、资金支持
资助
本工作得到了非传染性疾病国家重点研发计划[2023ZD0502400]、国家自然科学基金[92451303, 32270695, 32270719]以及江苏省现代农业重点研发计划[BE2023336]的支持。本文的开放获取出版费用由非传染性疾病国家重点研发计划[2023ZD0502400]提供。
作者声明没有利益冲突。
致谢
作者感谢Xin Yun Jing博士和Niubing Zhang博士对本文的评论。
K.X.Z.、C.X.L.、X.L.和P.H.设计了项目，监督实验，分析数据并撰写了手稿。K.X.Z.、C.X.L.、R.J.G.、Z.Z.、Q.L.和O.Y.M.进行了体外和体内实验及数据分析。H.L.L.和X.T.L.协助项目监督，并参与了数据分析和最终手稿的编辑。所有作者均同意本文内容。
