中性粒细胞胞外陷阱抑制纳米平台实现了对不同阶段类风湿性关节炎的全面治疗

《Journal of Controlled Release》：Neutrophil extracellular traps-inhibited nanoplatform achieves comprehensive treatment of rheumatoid arthritis at different stages

类风湿关节炎（RA）是一种以软骨和骨骼侵蚀为特征的自身免疫疾病，其发展可分为早期、中期和晚期阶段。现有治疗存在毒副作用大、疗效受限等问题，而激活的中性粒细胞持续浸润炎症关节并释放中性粒细胞胞外陷阱（NETs）加剧损伤。本研究构建了基于牛血清白蛋白（BSA）和sivelestat（ST）的ROS敏感型纳米药物递送系统（BTST NPs），利用BSA与中性粒细胞表面Fcγ受体特异性结合，通过激活中性粒细胞的迁移和吞噬能力实现靶向输送。体外实验证实BTST NPs在ROS刺激下可释放ST并抑制NETs释放，体内实验显示其能有效靶向RA炎症关节并抑制多阶段炎症反应。该成果为RA全阶段治疗提供了新策略。

　　

刘敏|刘思怡|刘明琪|杨涵|李晓芳|修静雅|张继龙|赵秀丽

沈阳药科大学药学院，中国沈阳110000

摘要

类风湿性关节炎（RA）是一种自身免疫性疾病，其特征是软骨和骨骼的侵蚀。RA的发病过程可以分为早期、中期和晚期三个阶段。这些阶段的发病机制尚未完全明了，这给开发能够有效治疗RA各个阶段的纳米制剂带来了巨大挑战。活化的中性粒细胞不断渗入炎症关节，并通过释放中性粒细胞胞外陷阱（NETs）加剧关节软骨和骨骼的损伤。因此，基于抑制NETs的给药系统有助于阻断一系列炎症反应级联和关节损伤，从而在RA的不同阶段实现有效治疗。为了实现对炎症关节的靶向治疗，我们利用活化中性粒细胞的吞噬功能和趋化性，设计了一种能够搭乘活化中性粒细胞到达炎症关节的给药系统（BTST NPs）。BTST是通过将牛血清白蛋白（BSA）和sivelestat通过ROS敏感的硫酮键连接起来合成的。活化中性粒细胞可以通过Fcγ受体与BSA之间的特异性结合吞噬BTST NPs，并将其运输到炎症关节。体外研究表明，BTST NPs可以在ROS的作用下释放ST，从而阻断NETs的释放。体内生物分布和药理学实验表明，BTST NPs能够被活化中性粒细胞高效运输到炎症关节，并在不同RA阶段表现出良好的治疗效果。BTST NPs的构建为在RA不同阶段的功能整合提供了一种新策略。

引言

类风湿性关节炎（RA）是一种破坏性的自身免疫性疾病，可导致持续的滑膜炎和骨骼损伤，最终使患者出现不可逆的功能障碍[1]、[2]。RA的发病过程是一个复杂的多步骤过程，可以分为早期、中期和晚期[3]、[4]、[5]。RA早期的传统治疗主要依靠非甾体抗炎药（NSAIDs）来缓解疼痛，而RA晚期则主要使用改变病情的抗风湿药（DMARDs）和糖皮质激素来抑制炎症[6]、[7]。然而，这些治疗方法常常导致严重的毒副作用（如白血病、肝脏损伤等），并且治疗效果有限[8]、[9]。因此，需要更深入地了解RA的发病机制，以开发出在RA各个阶段都有效的治疗方法。

RA的发病过程涉及复杂的信号网络，包括多种细胞因子的相互作用以及炎症细胞之间的复杂细胞间交流[10]。值得注意的是，炎症中性粒细胞是导致RA进展的主要罪魁祸首[11]、[12]。循环中的中性粒细胞在细胞因子的作用下被激活并渗入炎症关节，触发一系列信号事件，包括释放中性粒细胞胞外陷阱（NETs）以及产生趋化因子和细胞因子[13]、[14]、[15]。在RA的早期阶段，NETs促进瓜氨酸化自身抗原的外化，从而增强与RA发病机制相关的表位的表达[16]。在RA的中期和晚期阶段，NETs激活巨噬细胞，后者随后分泌细胞因子、炎症因子（IL-1β）和ROS，进一步加剧炎症反应，最终导致不可逆的骨骼损伤[17]。因此，抑制NETs的释放可能有助于有效缓解RA不同阶段的关节损伤。

sivelestat（ST）可以通过特异性抑制中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）来防止NETs的释放，并已被批准用于临床治疗急性肺损伤[18]、[19]。然而，由于其极短的半衰期，ST的临床应用受到很大限制[20]。因此，迫切需要开发一种能够延长ST循环时间并准确将其运输到炎症关节的给药系统。在我们之前的研究中，ST、聚乙二醇（PEG）和牛血清白蛋白（BSA）通过ROS敏感的硫酮键（TK）结合在一起，合成了BTST，该系统已被证明可以显著延长ST的循环时间，并在ROS的作用下释放药物[21]。BSA与活化中性粒细胞表面表达的Fcγ受体的特异性结合促进了BTST NPs被活化中性粒细胞摄取并运输到炎症关节[22]。在RA不同阶段，活化中性粒细胞在炎症部位的广泛浸润为BTST NPs向炎症关节的精确输送提供了基础。

在这项工作中，我们重点研究了BTST NPs在RA不同阶段的治疗效果和机制。BTST NPs能够靶向活化中性粒细胞，阻断NETs的释放，并抑制巨噬细胞的炎症反应。在RA的每个阶段，BTST NPs通过静脉注射进入小鼠体内后，可以被活化中性粒细胞特异性运输到炎症关节，阻断NETs的释放和一系列炎症反应，从而实现有效治疗。这项研究首次探讨了BTST NPs在RA不同阶段的治疗效果，为RA的全阶段治疗提供了一种新方法。

材料

BSA-PEG-TK-ST（BTST）是在我们的实验室合成的[21]。佛波尔12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA）、(Z-Ala-Ala-Ala-Ala)2Rh110和N-甲酰-甲硫氨酸-苯丙氨酸（fMLP）由Glpbio Inc.（美国）提供。Sytox green购自Thermo Fisher Scientific Inc.（美国）。FITC抗小鼠Ly-6G/Ly-6C（Gr-1）抗体和弹性蛋白酶中性粒细胞表达抗体（ELNE）购自ImmunoWay Biotechnology Company（美国）。抗组蛋白H3（CitH3）抗体、抗PSGL-1抗体、抗LFA-1抗体等也用于实验。

BTST NPs的制备与表征

BTST NPs是通过脱溶剂法制备的（图1A）。BTST NPs的外观为乳白色，并表现出Tindall效应（图1B）。DLS结果显示，BTST NPs的粒径为（128.4±2.2）nm，PDI值小于0.2（图1C）。BTST NPs的ζ电位为（-6.33±0.33）mV（图1D）。在研究血清稳定性、放置稳定性和稀释稳定性过程中，粒径、PDI值或ζ电位均未发生显著变化。

结论

在RA的不同阶段，大量活化中性粒细胞会迁移到炎症关节，并通过释放NETs加剧关节损伤。基于这一特性，我们设计并制备了BTST NPs，它们可以被活化中性粒细胞吞噬并运输到炎症关节。体外实验结果表明，BTST NPs可以在高ROS浓度下释放ST，阻断NETs的释放，并抑制由NETs引发的一系列炎症反应。

作者贡献声明

刘敏：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、验证、方法学设计、实验研究、数据分析。刘思怡：验证、实验研究、数据分析。刘明琪：验证、项目管理。杨涵：验证、实验研究。李晓芳：验证、数据管理。修静雅：验证。张继龙：验证。赵秀丽：监督、资源协调、概念构思。

利益冲突声明

无。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（82504718、82104108）、辽宁省自然科学基金 - 博士研究启动项目（2025-BS-0739）、辽宁省教育厅基础研究计划（LJ212510163007）、辽宁省教育厅重点研究项目（JYTZD2023136）、辽宁省教育厅一般项目（LJKZ0954）等机构的财政支持。