《Journal of Drug Delivery Science and Technology》：Erythrosine-loaded nanoemulsion prepared by low-energy method: advanced characterization,
in vitro release, and HET-CAM
ex vivo evaluation
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赤藓红是一种天然来源的光敏剂，但其在水性介质中稳定性差限制了其广泛应用。本研究针对这一问题，采用低能量方法成功开发了负载赤藓红的纳米乳剂(NEE)。研究发现，该纳米乳剂系统具有高负载率、优异的物理化学稳定性（货架期2.4个月）和缓释特性（符合Higuchi动力学）。通过加入Pluronic?F-127将其凝胶化后，进一步改善了其流变和质地特性。关键的HET-CAM实验证明该系统具有良好的生物相容性和抗血管生成潜力。这些结果为将赤藓红纳米乳剂开发为一种有前景的光动力疗法递送系统，用于治疗感染和癌症等疾病奠定了坚实的基础。
在抗击癌症和顽固性感染的医学前线，科学家们一直在寻找更精准、副作用更小的“光之武器”。光动力疗法（PDT, Photodynamic Therapy）就是这样一种颇具前景的策略，它利用特定波长的光激活一种被称为光敏剂（Photosensitizer）的药物，在目标组织内产生活性氧物种，从而精准地杀伤癌细胞或病原微生物。然而，找到理想的光敏剂并非易事。它需要高效、安全，并且能在体内“乖乖”到达目的地，在光照下稳定地发挥作用。赤藓红（Erythrosine），一种天然来源的红色染料，因其出色的光敏特性和良好的水溶性，进入了研究者的视线。它已被证明能有效对抗白色念珠菌（Candida albicans）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）乃至肝癌细胞。但“金无足赤”，赤藓红在水溶液中有一个致命的弱点——光稳定性极差，见光后容易迅速降解，这就像一把不稳定的“光剑”，大大限制了它在实际治疗中的应用。
那么，如何为这把“光剑”打造一个坚固耐用的“剑鞘”，保护它在抵达战场前不被“锈蚀”呢？来自巴西圣保罗州立大学（S?o Paulo State University）的研究团队将目光投向了纳米技术。他们想到的策略是：将赤藓红装载进纳米乳剂（Nanoemulsion）中。纳米乳剂是一种由油、水和表面活性剂组成的超微细液滴（通常直径在20-200纳米）分散体系，就像一个微型的“油包水”或“水包油”胶囊。这种结构不仅能将疏水性或稳定性差的药物包裹在核心，保护其免受外界环境影响，还能利用其纳米尺寸增强药物在生物体内的渗透和递送效率。更关键的是，本研究采用了“低能量方法”来制备这种纳米乳剂，这意味着不需要昂贵的高压均质或超声设备，仅通过巧妙的配方设计和简单的涡旋混合即可实现，大大降低了生产成本，为未来的规模化应用铺平了道路。
这项名为“Erythrosine-loaded nanoemulsion prepared by low-energy method: advanced characterization, in vitro release, and HET-CAM ex vivo evaluation”的研究成果，系统地报道了这一创新递送系统的开发、全面表征及初步生物学评价，并发表在了《Journal of Drug Delivery Science and Technology》期刊上。
为了构建并评估这一系统，研究人员主要运用了以下关键技术：首先，采用低能量相转变成分法构建伪三元相图，筛选出由聚山梨酯20（Tween 20）和脱水山梨醇单油酸酯（Span 80）组成的最佳表面活性剂对，确定了稳定的纳米乳剂形成区域。其次，通过动态光散射（DLS, Dynamic Light Scattering）和纳米颗粒追踪分析（NTA, Nanoparticle Tracking Analysis）对纳米乳剂的粒径、多分散指数（PDI, Polydispersity Index）和颗粒浓度进行表征；利用电泳迁移法测定其ζ电位以评估稳定性。再者，采用冷冻透射电子显微镜（Cryo-TEM, Cryogenic Transmission Electron Microscopy）和原子力显微镜（AFM, Atomic Force Microscopy）直观观察纳米乳剂液滴的形貌和分布。此外，研究还通过Franz扩散池进行了体外释放实验，并使用振荡流变仪和质构分析仪（TPA, Texture Profile Analysis）对凝胶化后的纳米乳剂进行了流变学和质构特性表征。最后，利用鸡胚绒毛尿囊膜实验（HET-CAM, Hen's Egg Test on the Chorioallantoic Membrane）这一经典的离体模型，评估了纳米乳剂的生物相容性和抗血管生成活性。
3.1. 不同表面活性剂对纳米乳化影响的研究
研究人员首先评估了多对非离子表面活性剂。结果表明，由聚山梨酯20（HLB 16.7）和脱水山梨醇单油酸酯（Span 80， HLB 4.3）组成的N2配方表现最佳，其纳米乳剂液滴尺寸为107.7 ± 2.438纳米，PDI为0.23 ± 0.021，ζ电位为-16.8 ± 0.208毫伏，且未出现乳析现象。这一配方被选为后续研究的基础。
3.2. 伪三元相图中纳米乳剂形成区域的确定
为了获得更稳定的配方（ζ电位绝对值>30毫伏），研究者构建了伪三元相图。从相图确定的纳米乳剂形成区域内部，进一步筛选出了I1和I2两个配方。这两个配方均具有小于200纳米的粒径、较低的PDI（<0.2）以及绝对值大于30毫伏的ζ电位，表明体系具有较高的静电排斥力，有利于长期稳定。
3.3. 赤藓红在纳米乳剂中的负载
将赤藓红以0.1毫克/毫升的浓度掺入I1配方（形成NEE），获得了最佳的物理稳定性。该负载纳米乳剂粒径为127.4 ± 1.877纳米，PDI为0.16 ± 0.017，ζ电位为-34.6 ± 0.252毫伏。含量测定显示，赤藓红在纳米乳剂中的负载效率超过100%，表明其与纳米乳剂体系具有高度的亲和性。
3.4. 通过动态光散射和电泳迁移率测定平均流体动力学直径和ζ电位
对负载赤藓红的纳米乳剂在不同应激条件（室温、37°C烘箱、5°C冰箱）下储存24小时后的表征显示，所有样品的粒径均在纳米范围（89.49至149.5纳米），PDI值较低（0.13至0.23），且ζ电位绝对值均高于29毫伏，表明初始物理化学性质良好。
3.5. 纳米颗粒跟踪分析（NTA）
NTA分析进一步证实了DLS的结果。负载赤藓红的纳米乳剂在室温下的平均流体动力学直径为110.0 ± 1.9纳米，颗粒浓度为5.20×1012± 1.83×1011颗粒/毫升，跨度指数（Span index）为0.378，表明体系粒径分布较窄，接近单分散。
3.6. 游离赤藓红和负载赤藓红纳米乳剂的荧光量子产率（Φf）和荧光寿命（τ）的测定
光物理性质表征发现，负载在纳米乳剂中的赤藓红，其荧光量子产率（Φf=0.31）低于在乙腈中的游离赤藓红（Φf=0.34），但高于在乙醇/NaOH中的标准品（Φf=0.14）。荧光寿命测量显示，纳米乳剂中赤藓红的τ值（0.22纳秒）远低于其在水溶液中的值（18.35纳秒）。这些变化提示纳米乳剂环境改变了赤藓红的激发态动力学，可能有利于其通过系间窜越产生更多活性氧，从而增强光动力疗效。
3.7. 稳定性研究
3.7.1. 不同应激条件随时间变化的影响：将负载赤藓红的纳米乳剂在三种条件下储存90天后，发现冷藏（5°C）条件对体系影响最小，液滴尺寸和ζ电位虽有变化，但赤藓红的含量保持稳定，未发生降解。
3.7.2. 通过分析离心进行长期稳定性研究：利用LUMiSizer?分析离心仪加速稳定性测试，估算出空白纳米乳剂和负载赤藓红纳米乳剂的货架期均为2.4个月。有趣的是，负载赤藓红的样品具有更低的沉降速度和失稳指数，表明活性成分的加入在一定程度上提升了体系的物理稳定性。
3.8. 傅里叶变换衰减全反射红外光谱（FTIR-ATR）分析
红外光谱显示，在负载赤藓红的纳米乳剂谱图中，原材料（赤藓红、Tween 20、Span 80、肉豆蔻酸异丙酯）的特征峰消失，出现了代表水的羟基宽峰和可能由原材料相互作用产生的烯烃峰。这证实了赤藓红被成功包载，并形成了新的纳米结构。
3.9. 原子力显微镜（AFM）
AFM图像显示了负载赤藓红纳米乳剂液滴的球形形貌和亚微米尺寸，证实了纳米结构的形成。
3.10. 冷冻透射电子显微镜（Cryo-TEM）
Cryo-TEM图像更直观地展示了负载赤藓红纳米乳剂在近自然液态下的状态：液滴呈球形，尺寸均一（小于200纳米），且分散良好，无聚集或 coalescence（聚结）迹象，完美印证了此前DLS和NTA的数据。
3.11. 纳米乳剂的凝胶化
为优化临床使用（如局部给药），将筛选出的最佳负载纳米乳剂配方与23%的Pluronic?F-127在冰浴下混合，制成了凝胶化纳米乳剂。
3.12. 凝胶化纳米乳剂的流变学
流变学测试表明，凝胶化纳米乳剂是一种具有屈服应力的假塑性非牛顿流体。在频率扫描振荡测试中，其储能模量（G'）始终大于损耗模量（G”），表明材料在整个测试频率范围内表现出以弹性为主的固体样凝胶行为，结构稳定。
3.13. 凝胶化纳米乳剂的质构剖面分析（TPA）
TPA测得其平均硬度为8.48 ± 2.06克，压缩性为31.65 ± 4.98克·秒，粘附性为25.39 ± 4.97克·秒，内聚性为0.812 ± 0.044。这些数值与其他文献报道的凝胶化纳米乳剂体系相符，表明其具有适宜的涂抹性和机械性能。
3.14. 使用Franz池测定凝胶化纳米乳剂中赤藓红的体外释放曲线
体外释放实验显示，游离的赤藓红溶液在2小时内即释放了80%，而凝胶化纳米乳剂中的赤藓红在24小时内仅缓释了约20%。释放动力学数据最符合Higuchi模型，这表明赤藓红从这种凝胶基质中的释放是一个以Fick扩散为主导的缓释过程。
3.15. 使用鸡胚绒毛尿囊膜实验（HET-CAM）离体评估NEE的生物相容性和抗血管生成活性
3.15.1. 生物相容性实验：HET-CAM实验结果显示，磷酸盐缓冲液（PBS）阴性对照和未负载药物的纳米乳剂未引起任何血管损伤。所有测试浓度（1.0, 2.5, 5.0微克/毫升）的负载赤藓红纳米乳剂也表现出了优异的生物相容性，未引起显著的血管溶解、出血或凝血，刺激性评分极低。相比之下，游离的赤藓红（5.0微克/毫升）产生了轻度刺激，而0.1 M NaOH阳性对照则引起了严重的血管损伤和鸡胚死亡。这一结果清晰地表明，将赤藓红封装进纳米乳剂中，显著降低了其潜在的刺激性，提高了生物相容性。
3.15.2. 抗肿瘤功效：抗血管生成活性：在评估抗血管生成潜力的实验中，负载赤藓红的纳米乳剂（5.0微克/毫升）表现出了显著的抑制血管生成的效果，其血管抑制百分比与阳性对照药物阿霉素（30%）相当，而游离赤藓红在相同浓度下效果较弱。这提示纳米乳剂系统不仅能保护赤藓红，还可能通过增强其递送或改变其与微环境的相互作用，从而提升了其抑制新血管形成的生物活性。
综上所述，这项研究成功地利用低能量方法开发了一种负载天然光敏剂赤藓红的纳米乳剂递送系统。该系统展现出了高负载效率、良好的物理化学稳定性、适宜的纳米尺寸与形貌、以及从凝胶化剂型中缓释药物的特性。最引人注目的发现来自于生物学评价：纳米乳剂化不仅没有损害赤藓红的光敏活性，反而显著提升了其生物相容性，并增强了其抗血管生成的作用。这些结果具有多重重要意义：首先，它为解决赤藓红在水性环境中不稳定的技术瓶颈提供了一个有效且低成本的纳米技术方案。其次，该研究为将这种常见的食品色素重新“武装”为一种高效、安全的PDT光敏剂开辟了新途径，使其在治疗真菌/细菌感染和癌症（尤其是通过抑制肿瘤血管生成）方面具有巨大的应用潜力。最后，整个研究从配方设计、物化表征到生物学评价形成了一个完整的闭环，为基于纳米乳剂的天然产物递送系统开发提供了详实的方法学参考和可靠的数据支持。这项工作是纳米技术与光动力疗法交叉领域的一次有力尝试，为开发下一代性能更优、成本更低的光疗药物递送系统奠定了坚实的基础。
