《Journal of Drug Delivery Science and Technology》：Preparation of the multifunctional excipient ε-polylysine-protocatechuic acid and its application in eye drops
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本研究通过碳二亚胺法将protocatechuic acid（PA）接枝至ε-polylysine（ε-PL），制备出ε-PL-PA材料。联合berberine hydrochloride（BBR）开发新型干眼症眼用制剂，体外实验显示ε-PL-PA/BBR体系具有协同抗菌抗氧化抗炎作用，且通过NMR证实接枝反应成功。体内实验表明该体系可有效修复角膜及结膜损伤，提升泪液中维生素D水平，改善干眼症状，效果优于市售Ciclosporin A，且无刺激性。研究为开发高效低毒眼用抗菌剂提供新思路。
王广杰|张丽丹|孙长山|江同英
沈阳药科大学药学院，中国沈阳110016
摘要：
本研究的目的是制备一种具有抗菌、抗氧化和抗炎作用的眼用辅料，并将其与盐酸小檗碱（BBR）结合，用于治疗干眼症。通过碳二亚胺偶联法制备了原儿茶酸接枝-ε-聚赖氨酸（ε-PL-PA）。通过体外抗菌实验和自由基清除实验筛选并确定了ε-PL-PA的取代程度及其与BBR的结合比例。角膜渗透实验和眼组织分布实验结果表明，ε-PL-PA能够增强BBR在角膜中的渗透性并延长其在眼内的停留时间。Schirmer I试验、泪液破裂时间试验、泪液分层试验、荧光素染色试验、眼部组织中维生素D水平的评估以及组织病理学检查结果显示，ε-PL-PA/BBR对修复角膜和结膜损伤、改善泪液中的黏蛋白和无机盐成分、降低角膜中的促炎因子IL-1β以及提高眼部维生素D水平具有良好效果，其效果可与市售的环孢素A相媲美。ε-PL-PA与BBR的组合在抗氧化、抗菌和抗炎作用方面表现出协同效应，尤其在干眼症的治疗中效果显著。本研究为开发高效低毒的眼用抗菌剂提供了新的思路，在治疗干眼症等眼部表面疾病方面具有重要的应用前景。
引言
干眼症（DES）是一种全球普遍存在的眼部表面疾病，与糖尿病和甲状腺疾病等系统性疾病存在复杂的关联，对公共健康构成严重威胁[1]、[2]、[3]。临床研究表明，干眼症患者通常需要长期使用眼药水进行治疗。长期使用含有抗菌剂的眼药水会导致泪液分泌减少和泪膜不稳定，从而形成恶性循环，使病情加重[4]、[5]、[6]、[7]。研究还表明，长期使用含有抗菌剂的抗青光眼眼药水可能会损害上皮细胞和角膜神经，并降低抗青光眼手术的效果[8]、[9]、[10]。
ε-聚赖氨酸（ε-PL）是一种天然存在的阳离子多肽，由赖氨酸单体通过肽键连接而成，具有很强的抗菌活性。ε-PL不仅对环境和人体无害，而且根据相关法律法规已被批准作为食品添加剂[11]。ε-PL通过与微生物细胞表面的静电相互作用发挥抗菌作用，导致细胞质分布异常和细胞外膜变形[12]。此外，当ε-PL与细胞表面结合时，它可以穿透细胞并抑制细菌的代谢过程，最终实现杀菌效果[13]、[14]。当ε-PL与其他抗菌剂结合时，通常会表现出协同效应[15]。天然多酚因其多方面的生物活性和高生物安全性而受到广泛关注[16]。作为天然阳离子多肽，ε-PL的侧链上含有氨基，这些氨基可以作为化学修饰位点，因此将各种多酚接枝到ε-PL上可以生成具有显著抗氧化和抗炎活性的多酚功能化ε-PL[17]、[18]、[19]、[20]。
原儿茶酸（PA）是一种天然存在的多酚化合物，对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株均具有广谱抗菌活性[21]。PA中的儿茶酚基团能够有效清除自由基，从而赋予其出色的抗氧化能力。这种双功能化合物具有多种保护作用：减轻细胞氧化损伤、抑制脂质过氧化过程，并协同增强抗菌效果[22]、[23]、[24]。此外，PA通过影响关键的炎症信号通路（尤其是NF-κB级联反应）发挥抗炎和免疫调节作用，有效下调促炎细胞因子（如IL-6、TNF-α）的表达，从而减轻炎症组织损伤[25]。最新研究表明，接枝了PA的壳聚糖（CS）比天然CS具有更强的抗氧化能力和抗菌效力[26]、[27]，值得注意的是，这两种生物活性都与PA的取代程度呈正相关[28]。
盐酸小檗碱（BBR）是一种异喹啉生物碱，具有抗病毒、抗炎和抗氧化作用[29]、[30]、[31]、[32]。然而，作为生物药剂分类系统（BCS）III类化合物，BBR的角膜渗透性较差，眼内停留时间较短，这大大限制了其治疗效果[33]。相比之下，ε-PL通过调节膜通透性的细胞表面相互作用表现出增强渗透性的特性，这种机制有助于提高药物在眼部的穿透性并改善组织吸收，从而提高生物利用度[34]。
在本研究中，使用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）作为偶联试剂，通过碳二亚胺介导的酰胺化反应将原儿茶酸（PA）接枝到ε-聚赖氨酸（ε-PL）上。反应过程如图1所示。ε-PL本身具有抗菌活性，通过与原儿茶酸形成酰胺键后，这种改性结构不仅保持了原有的抗菌效果，还获得了额外的抗氧化和抗炎能力。
所得到的ε-PL-PA随后与盐酸小檗碱（BBR）和羟丙基甲基纤维素（HPMC）结合，制备出符合眼部制剂标准的均匀眼用溶液（ε-PL-PA/BBR眼药水）。HPMC是一种亲水性聚合物，具有优异的生物相容性，常用于眼部制剂中，且与合成辅料具有良好的相容性，因此被选为该制剂的黏度调节剂[35]。这种组合在抗菌、抗氧化和抗炎作用方面表现出协同增效效应。重要的是，该制剂利用了ε-PL-PA的固有抗菌能力来保持无菌状态，避免了使用传统的防腐剂，从而避免了化学抗菌剂可能引起的眼部表面毒性。
材料
ε-聚赖氨酸、原儿茶酸和盐酸小檗碱购自Macklin（中国上海）。荧光素钠购自大连美伦生物科技有限公司。苯扎氯铵购自上海阿拉丁（中国上海）。大鼠维生素D ELISA试剂盒购自上海友轩生物科技有限公司。本研究中使用的所有其他溶剂和试剂均为分析级或色谱级。
动物
本研究使用的是体重在
1H核磁共振光谱（1H NMR）
PA、ε-PL和ε-PL-PA的1H NMR谱图如图2A所示。PA的特征峰主要位于δ 6.5–8.0 ppm（苯环的芳香质子）和δ 9.0 ppm（羧酸质子）。ε-PL的特征峰位于δ 1.0–2.0 ppm（脂肪族骨架质子）和δ 2.5–3.5 ppm（α-和ε-位质子）[65]。其中，由于D2O中的氘取代作用，ε-PL的酰胺键的特征峰的质子信号可能被掩盖[66]。
结论
本研究成功合成了ε-PL-PA（MV4526.4），并开发了ε-PL-PA/BBR眼药水制剂，证明了ε-PL-PA与BBR之间的显著协同抗菌和抗氧化作用。与BAC/BBR眼药水制剂相比，ε-PL-PA/BBR系统没有引起眼部刺激。体内药效学评估证实了该制剂在改善大鼠干眼症临床症状方面的有效性，包括显著缓解角膜上皮损伤
作者贡献声明
王广杰：撰写——初稿、可视化、实验设计。孙长山：撰写——审阅与编辑。张丽丹：方法学研究、实验设计、概念构思。江同英：撰写——审阅与编辑、资源获取
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究结果的财务利益或个人关系。
致谢
本研究未获得公共部门、商业机构或非营利组织的任何特定资助。
