《Smart Molecules》：Stepwise mitochondria-targeted photodynamic immunotherapy enabled by an outer membrane vesicles-based nanoplatform for synergistic tumor ablation and immune reprogramming
1 INTRODUCTION
免疫疗法通过直接激活或恢复抗肿瘤免疫反应来抑制肿瘤生长、转移和复发，已从根本上改变了临床癌症治疗。作为一种有吸引力的免疫治疗策略，癌症疫苗旨在通过递送肿瘤相关抗原来引发抗原特异性免疫反应。然而，这些方法的主要限制是个体免疫反应存在显著差异，这可能会影响治疗效果。相比之下，光动力增强的免疫反应提供了一种更广泛适用的替代方案。这种方法能在光激活下有效根除肿瘤细胞，同时启动持久的系统性免疫效应。光疗与免疫疗法的整合不仅能增强肿瘤免疫原性，还能提高不同患者群体的治疗效果。
细菌外膜囊泡（OMVs）是革兰氏阴性菌分泌的双层纳米结构，近年来已成为极具前景的治疗性递送载体。典型尺寸在20到200纳米之间，OMVs由脂多糖（LPS）、肽聚糖、周质蛋白和其他富含病原体相关分子模式的外膜成分组成。越来越多的证据表明，OMVs可以有效募集免疫细胞，启动抗肿瘤免疫反应，并通过将巨噬细胞重编程为促炎的M1表型来增强免疫介导的细胞毒性。与其他细胞外囊泡类似，OMVs表现出优异的生物相容性，并可以被工程化用于多功能应用。值得注意的是，作为肿瘤微环境的关键组成部分，细菌倾向于定植于缺氧区域，这使得OMVs通过缺氧定向趋化性具备了固有的肿瘤靶向能力。这种独特的特性允许OMVs在保留其固有生物学功能的同时，作为小分子药物、抗体和RNA等多种治疗剂的递送载体。因此，OMVs通过提供在缺氧实体瘤中的高效靶向、渗透和积累，为增强治疗效果提供了一种有吸引力的策略。
光动力疗法（PDT）是一种将药物与特定光源结合的前沿治疗方法。其机制依赖于光敏剂在光照下发生光化学反应，将氧气转化为高细胞毒性的活性氧，例如单线态氧（1O2）、超氧阴离子（O2•?）和羟基自由基（•OH）。由于其微创性、副作用少和协同潜力，PDT被广泛推荐用于治疗黑色素瘤和导管癌等实体瘤。然而，PDT的临床成功高度依赖于所使用的光敏剂。传统光敏剂通常存在水溶性差的问题，导致在生理条件下聚集，并因聚集引起淬灭（ACQ）而导致ROS产生效率下降。为了解决这个问题，唐等人引入了一类新的光敏剂，它们表现出聚集诱导发光（AIE）效应，其中聚集增强了荧光和ROS的产生，显著提高了肿瘤杀伤效力。尽管取得了这些进展，PDT的一个主要临床限制是对正常组织的光毒性，这是由于小有机分子对肿瘤的靶向性不足及其“始终开启”效应造成的。因此，开发具有高效肿瘤靶向性和最小脱靶效应的新型光动力剂对于克服这些挑战至关重要。此外，由于癌症进展涉及多种信号通路，单一治疗往往无法达到最佳治疗效果。相比之下，结合多个靶点或机制可以产生超越单一治疗效果总和的协同效应，同时有效对抗肿瘤耐药性。
近年来，基于OMV的光敏剂系统已成为光动力免疫治疗的有前途平台，它们利用细菌囊泡固有的免疫刺激特性和其药物递送能力。然而，大多数已报道的基于OMV的PDT系统主要将OMVs用作增强肿瘤积累或免疫激活的被动载体，而光敏剂的细胞内命运和光动力损伤的时空控制在很大程度上仍未得到探索。此外，许多这些系统依赖于传统的、含重原子的光敏剂，这些光敏剂通常存在ACQ、暗毒性和在缺氧肿瘤条件下性能受损的问题。在此，我们报告了一种机制独特的基于OMV的光动力免疫治疗平台BDPM@OMVs，它将光敏剂分子工程、逐步亚细胞靶向和免疫微环境重编程整合到一个单一系统中。一种新型无重原子AIE光敏剂（BDPM）被合理设计，以实现高效的I型/II型双模式ROS生成和固有的线粒体靶向性。在OMV介导的细胞内存作用后，BDPM@OMVs经历光触发的光化学内化，诱导溶酶体破裂和BDPM随后向线粒体的转位，从而实现从溶酶体到线粒体的序贯光动力放大。重要的是，除了作为递送载体外，OMVs通过促进巨噬细胞从M2表型向M1表型复极化而积极参与抗肿瘤免疫。这种独特的结合赋予BDPM@OMVs在缺氧条件下强大的光动力功效以及针对实体瘤的协同光动力-免疫治疗活性。总之，这项工作通过强调亚细胞光动力精准性和免疫调节，而非仅仅是载体功能，为基于OMV的光敏剂系统建立了一个新的设计范式。
2 RESULT AND DISCUSSION
2.1 Design and performance of photosensitizer
引入重原子是提高光敏剂ROS生成效率的常用方法。然而，这种方法通常会导致暗毒性增加和光稳定性降低，这可能对其生物学应用有害。增强分子内电荷转移（ICT）效应是降低最高占据分子轨道-最低未占据分子轨道能隙的一种有前途的策略，从而增加系间窜越的可能性并提高ROS生成效率。氟硼二吡咯是一种强吸电子基团，可以显著增强ICT效应。在这项工作中，我们开发了BDPM，一种具有AIE效应的新型无重原子BODIPY光敏剂。三苯胺基团类似于蝴蝶的翅膀，氟硼联吡咯作为主体，三苯基膦作为引导分子朝向线粒体的天线。这种蝴蝶形分子由于两个三苯胺基团的螺旋桨状构型，显著抑制了分子内π-π堆积的形成，有助于提高荧光亮度。BDPM是使用两个三苯胺分子作为电子给体，氟硼二吡咯作为电子受体合成的。
所有化合物均通过电喷雾电离质谱（ESI-MS）、1H NMR和13C NMR进行了全面表征（图S21-S29）。我们系统地评估了BDPM的光谱特性。如图所示，BDPM在PBS中的紫外吸收范围为550–650纳米，峰值吸收在600纳米。BDPM的荧光发射强度在DMSO/H2O体系中随着水含量的增加而显著增强了386倍，显示出优异的AIE特性。BDPM在聚集状态下的发射光谱覆盖600–750纳米，最大发射在648纳米，处于近红外区域，有利于生物成像应用。
BDPM的单线态氧量子产率是使用9,10-蒽二基-双（亚甲基）二丙二酸（ABDA）在PBS中测定的。此外，我们使用DCFH-DA（用于总ROS）和DHR123（用于O2•?）评估了BDPM在光照下产生的ROS和超氧阴离子。BDPM在白光照射下显示出优异的ROS生成能力，DCFH和DHR123的荧光强度分别增加了42倍和80倍，优于商业光敏剂RB（玫瑰红）。电子顺磁共振光谱进一步验证了BDPM产生的ROS类型，使用2,2,6,6-四甲基哌啶（TEMP）作为单线态氧捕获剂和5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）作为超氧阴离子捕获剂。总之，BDPM是一种高效的I型和II型混合光敏剂。
2.2 Theoretical studies on the photodynamic mechanism
为了更深入地理解光动力机制，我们使用密度泛函理论（DFT）和含时密度泛函理论计算进行了广泛的理论计算研究，以探究BDPM的光物理和电子特性。我们首先使用B3LYP/def2-SVP泛函优化了基态结构以获得局部最优构象。然后进行频率计算以确认优化结构的准确性。基于优化后的几何结构，我们使用包括B3LYP/def2-TZVP、CAM-B3LYP/def2-TZVP、PBE0/def2-TZVP和M06-2X/def2-TZVP在内的多种泛函计算了激发能，并将计算的吸收波长与实验结果进行了比较。发现PBE0/def2-TZVP确定的激发能最接近实验值，使我们能够推导出该结构的T态激发能。
结果显示BDPM的S1态和T2态之间能级差很小（ΔE(ST) = 0.05 eV），有利于系间窜越（ISC）。接下来，我们分析了激发态电子跃迁。电子-空穴分析表明，BDPM的S1态在激发时表现出混合的电荷转移（CT）/局部激发（LE）特性。在CT态中，CT发生在三苯胺（TPA）部分到吸电子基团之间。我们进一步使用片段间电荷转移（IFCT）分析了S1态和T2态中激发类型的比例。结果表明，BDPM从S1态到T2态的跃迁伴随着CT特征的显著减少和LE特征的显著增加（ΔCT% = 47.95），这促进了ISC过程。这些发现表明，所设计的光敏剂BDPM能够发生系间窜越，显示出生成1O2的巨大潜力。
在ROS中，1O2具有更高的细胞毒性，使得II型PDT对肿瘤细胞具有更高的光毒性。然而，超过90%的实体瘤表现出缺氧微环境，而II型PDT的氧依赖性限制了相应光敏剂在这些肿瘤中的治疗效果。相比之下，涉及生物催化氧循环的I型光响应氧依赖性较低，使得I型光敏剂在缺氧肿瘤中更有效。因此，BDPM这种无重原子但具有优异ROS生成能力的新型混合光敏剂，在治疗缺氧肿瘤细胞方面显示出巨大前景。
2.3 Construction of photosensitizer-encapsulated OMVs
外膜囊泡是具有负电荷表面的双层囊泡状球形纳米颗粒。这种脂质双层结构不仅便于OMVs进入宿主细胞，还允许药物在囊泡内高效负载。我们采用低能量超声将BDPM包封到OMVs的疏水层中，实现有效负载。首先，通过超速离心法从大肠杆菌DH5α中成功分离出OMVs，通过BCA蛋白定量测定其浓度为0.72毫克/毫升。透射电子显微镜证实了所提取OMVs的双层囊泡结构。随后，利用超声辅助纳米沉淀法将BDPM高效地负载到OMVs中，形成BDPM@OMVs纳米复合物。
为了评估OMVs在负载光敏剂前后是否发生变化，我们首先使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析了OMVs的蛋白质谱。在光敏剂包封后未观察到显著变化，证实了OMVs的免疫原性得以保留。通过透射电子显微镜观察到的颗粒尺寸与动态光散射测定的平均尺寸一致，分别为33.5和43.1纳米。尺寸的增加进一步支持了BDPM成功负载到OMVs中。Zeta电位测量显示，负载BDPM后，电位从-37.3毫伏增加到-31.5毫伏。这些结果证实OMVs独特的囊泡结构得以保留，成功制备了BDPM@OMVs杂化囊泡纳米颗粒。
在成功制备OMV杂化物后，我们研究了BDPM@OMVs的光学和光动力特性。结果表明，BDPM和BDPM@OMVs的紫外吸收和荧光发射光谱是一致的。值得注意的是，与游离的BDPM相比，BDPM@OMVs表现出更高的摩尔吸光系数和荧光强度，这可能是由于封装后聚集状态的变化所致。使用三种不同的ROS指示剂评估了BDPM@OMVs的ROS生产效率。BDPM@OMVs产生的ROS略多于游离的BDPM。这种增加可能归因于BDPM在OMVs内聚集状态的改变。此外，BDPM@OMVs能够同时产生单线态氧和超氧阴离子。电子顺磁共振光谱进一步证实了产生的ROS类型。值得注意的是，无论BDPM是否被封装在OMVs中，BDPM@OMVs都表现出比RB更高的ROS生成效率。
2.4 BDPM@OMVs targets cancer cells in vitro
由于OMVs的双层囊泡结构，它们可以通过膜融合和内存作用两种方式轻松进入肿瘤细胞。BDPM的持久荧光使其能够追踪OMVs被肿瘤细胞的内吞情况。为了确认BDPM@OMVs在体外被肿瘤细胞内吞的能力，进行了细胞摄取实验。如图所示，与游离的BDPM相比，BDPM@OMVs表现出更快速、更高效的内化到肿瘤细胞中。此外，BDPM的正电荷使其在细胞内释放后能够特异性染色活细胞的线粒体。作为纳米级载体，OMVs在细胞摄取后被运输到溶酶体中。通过光激活产生足够的ROS后，溶酶体膜的通透性发生改变，释放出BDPM和OMVs，这一过程被称为光化学内化。
为了验证这一细胞摄取和内化过程，在活细胞中进行了细胞器共定位实验。结果表明，与BDPM@OMVs孵育30分钟的MDA-MB-231细胞中，BDPM的红色荧光与溶酶体的绿色荧光高度共定位，表明BDPM@OMVs主要定位于溶酶体中。在620纳米激光照射3分钟后，绿色和红色荧光都从聚集状态转变为弥散状态，细胞似乎发生膨胀，共定位系数下降。同时，线粒体绿色荧光和BDPM红色荧光的共定位系数在光照前后从0.30增加到0.82。这些结果表明，BDPM@OMVs在细胞摄取后首先进入溶酶体，在光激活后，BDPM从溶酶体逃逸并定位于线粒体。BDPM表现出优异的线粒体靶向能力。这一创新设计不仅有利于多细胞器损伤，还能防止OMVs进入溶酶体后被细胞酶消化降解，从而协同增强光动力和免疫治疗的疗效。
2.5 Eradication of cancer cells in vitro
BDPM@OMVs显著的光动力活性促使我们探索在共孵育期间，由BDPM@OMVs产生的ROS是否能有效灭活癌细胞。三阴性乳腺癌是一种对常规免疫治疗反应差的“冷”肿瘤，是最具侵袭性和危险的乳腺癌类型。因此，在常氧和缺氧条件下，将BDPM或BDPM@OMVs与三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231共培养，然后用白光照射30分钟。使用MTT分析评估细胞活力。结果表明，在黑暗条件下，BDPM和BDPM@OMVs对细胞均无明显毒性。然而，在白光照射后，当BDPM@OMVs的浓度超过6微摩尔时，细胞活力降低了80%。即使在缺氧条件下，BDPM和BDPM@OMVs也显示出根除MDA-MB-231细胞的能力，这可能是由于I型光动力治疗的氧依赖性较低所致。此外，BDPM@OMVs在消除小鼠来源的乳腺癌细胞系4T1方面也显示出高光灭活效率。
通过荧光成像进一步评估了BDPM@OMVs对MDA-MB-231细胞的光毒性。将BDPM@OMVs与MDA-MB-231细胞共培养30分钟，然后暴露于白光照射30分钟。随后，使用LIVE/DEAD?细胞成像试剂盒对培养的细胞进行染色。与MTT结果一致，大多数MDA-MB-231细胞被碘化丙啶（PI）染色，表明细胞膜被破坏，细胞已经死亡。相比之下，在黑暗条件下，MDA-MB-231细胞主要被钙黄绿素-AM（CAM）染色，表明BDPM@OMVs的暗毒性较低。即使在缺氧条件下，相同浓度的BDPM@OMVs也消灭了大多数癌细胞，只有少数存活。这些结果表明，BDPM@OMVs不仅被癌细胞有效摄取，而且在光激活条件下也能被高效清除。
为了进一步验证BDPM@OMVs在被癌细胞摄取后仍能被光激活产生ROS，我们使用各种光学探针检测了在BDPM@OMVs存在下，MDA-MB-231细胞中ROS的类型和水平。使用DCFH-DA评估了细胞内总ROS含量，结果表明，在常氧和缺氧条件下，BDPM@OMVs在MDA-MB-231细胞中被有效光激活以产生大量ROS。在添加单线态氧淬灭剂叠氮化钠后，绿色荧光信号减弱甚至消失。
随后，使用DHR123研究了细胞内超氧阴离子的产生，荧光成像显示，在常氧和缺氧条件下，BDPM@OMVs均显著增加了细胞内线粒体超氧阴离子的水平。在添加超氧阴离子淬灭剂L-抗坏血酸（Vc）后，荧光也被淬灭。这些结果进一步证实，BDPM@OMVs可以被光激活以产生单线态氧和超氧阴离子。即使在缺氧条件下，BDPM@OMVs也能通过光化学过程提高细胞内ROS水平，从而有效根除癌细胞。
2.6 Apoptosis induced by BDPM@OMVs
上述实验数据表明，BDPM@OMVs是一种有效的根除肿瘤细胞的PDT制剂。为了进一步阐明BDPM@OMVs的详细治疗机制，我们评估了MDA-MB-231细胞的死亡模式。细胞凋亡是PDT诱导的最常见的细胞死亡形式。一旦线粒体受损，它们就会失去膜电位，从而触发细胞凋亡。考虑到BDPM的线粒体靶向性，使用JC-1检测了线粒体膜电位（MMP）的变化。对照组和黑暗组的MDA-MB-231细胞显示出强烈的红色荧光，表明MMP值很高。相比之下，BDPM和BDPM@OMVs在白光照射后导致MMP下降，这通过增强的绿色荧光反映出来，这与线粒体功能障碍相关，并与细胞毒性测定结果相符。
此外，我们使用膜联蛋白V-FITC和PI的双重荧光检查了细胞凋亡，其中FITC的绿色荧光指示细胞凋亡，PI的红色荧光标记细胞死亡。如图所示，对照组和黑暗组没有观察到明显的红色或绿色荧光。相比之下，经BDPM和BDPM@OMVs处理的细胞在照射后显示出增强的绿色和红色荧光。一些凋亡细胞仅被FITC标记，表明它们正在发生凋亡。
OMVs是有效的免疫调节剂，因此，通过光内化释放的OMVs有望与巨噬细胞相互作用并发挥免疫调节作用。这通过检查巨噬细胞的复极化来研究。在肿瘤微环境中，M2型巨噬细胞占主导地位，并分泌抗炎因子如IL-10和TGF-β，从而抑制免疫反应。相比之下，M1型巨噬细胞通过分泌TNF-α和IL-1β主动促进免疫反应。在形态上，M2型巨噬细胞通常呈现椭圆形、煎蛋状，而M1型巨噬细胞则呈现煎蛋状和纺锤形的混合形态。我们使用IL-4成功诱导RAW264.7巨噬细胞极化为M2型，呈现煎蛋状。在与脂多糖（LPS）（一种M1型巨噬细胞诱导剂）和BDPM@OMVs共孵育后，M2型巨噬细胞的形态发生改变，一些细胞伸出伪足。这些结果表明，BDPM@OMVs中存在的LPS可能有效地促进M2巨噬细胞向M1表型的转变。
为了进一步验证M1巨噬细胞的产生，使用ELISA试剂盒测量了细胞外细胞因子TNF-α和IL-1β。结果表明，单一分子BDPM不能刺激RAW264.7细胞的极化。相比之下，OMVs和BDPM@OMVs，与LPS类似，有效地促进了极化并上调了M1巨噬细胞中促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的分泌。为了证实这些发现，通过流式细胞术分析了M1巨噬细胞中常见表达的标志物CD86的表达。流式细胞术结果显示，OMVs组和BDPM@OMVs组均显示出显著的PE荧光信号。总之，这些实验结果表明OMVs具有促进M2巨噬细胞向M1巨噬细胞复极化的潜力，从而通过调节免疫抑制的肿瘤微环境来增强免疫治疗。
2.7 Anti-tumor efficacy of photodynamic immunotherapy in vivo
使用4T1小鼠乳腺癌模型进一步评估了OMVs对肿瘤的靶向和治疗效果。通过将4T1小鼠乳腺癌细胞系接种到BALB/c小鼠体内，建立了皮下乳腺癌肿瘤模型。尾静脉注射BDPM@OMVs后，使用激发/发射波长为550/660纳米的IVIS成像系统评估体内荧光分布。最初，在肿瘤部位未观察到荧光信号。然而，6小时后，肿瘤部位出现荧光信号，表明BDPM@OMVs正在积累。随着时间的推移，肿瘤部位的荧光信号逐渐增强，在48小时达到峰值。在48和96小时对主要器官和肿瘤进行离体组织成像，结果显示在48小时时，光敏剂在肝脏和肿瘤部位发出强荧光。到96小时，肝脏和肿瘤部位的荧光均显著减弱。相比之下，注射BDPM的小鼠在肿瘤部位没有显示出明显的荧光。这些结果表明，BDPM@OMVs有效靶向肿瘤组织，这归功于OMVs高效的肿瘤靶向能力，并且在48小时后从主要器官代谢，从而最大限度地减少了对正常组织的毒性。
基于证明BDPM@OMVs有效靶向肿瘤组织和治疗效果的数据，我们进一步研究了其在4T1荷瘤小鼠中的抗肿瘤功效。具体来说，将4T1荷瘤小鼠分为六组。尾静脉注射后，小鼠在12小时后接受或不接受606纳米光照射。治疗重复一次，光照间隔为7天，所有小鼠在18天后被安乐死以收集肿瘤。结果显示，只有BDPM@OMVs加光照组显示出约85%的肿瘤生长抑制。在整个治疗期间，所有实验组小鼠的体重保持稳定。这些发现表明，BDPM@OMVs具有优异的生物相容性和有效的抗肿瘤活性，进一步凸显了PDT与免疫治疗相结合的优势。
为了进一步评估BDPM@OMVs的抗肿瘤功效，我们对荷瘤小鼠分离出的肿瘤进行了一系列病理分析，包括H&E、TUNEL和Ki67染色。H&E染色显示，在BDPM+光照、BDPM@OMVs和BDPM@OMVs+光照组中，只有少数细胞形态完整，许多细胞核呈现收缩或破裂。TUNEL染色显示，由绿色荧光指示的凋亡细胞显著增加。此外，Ki67染色显示增殖肿瘤细胞的比例减少，浅棕色染色减少证明了这一点。其中，BDPM@OMVs+光照组对细胞死亡和肿瘤抑制的影响最为明显。这些结果证实，BDPM@OMVs诱导的光免疫疗法可以实现优异的抗肿瘤功效。
为了评估BDPM@OMVs的生物相容性，进行了红细胞裂解实验。使用PBS作为阴性对照，去离子水作为阳性对照，即使在BDPM@OMVs浓度高达200微克/毫升时，也未观察到显著的溶血（大于5%）。此外，对4T1荷瘤小鼠主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）的H&E染色未显示明显的病理变化。血清生化分析，包括丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、肌酐（CREA）和血尿素氮的测量，显示数值均在正常范围内，表明没有明显的肝肾毒性。最后，对L-02正常人肝细胞和RAW264.7巨噬细胞的MTT测定显示，在测试的浓度范围内，细胞活力均高于80%。这些发现表明，BDPM@OMVs表现出优异的生物安全性。
3 CONCLUSION
在这项研究中，我们开发了BDPM@OMVs，这是一种将无重原子的AIE光敏剂（BDPM）与细菌OMVs相结合的新型纳米平台。该平台是第一个为光动力免疫治疗设计的基于OMV的系统。我们的BDPM光敏剂同时具有I型和II型光动力活性，能够在不使用重原子的情况下高效产生ROS，从而优于玫瑰红等传统光敏剂。BDPM@OMVs利用了PDT和免疫调节的双重优势。OMV载体促进了向肿瘤部位的靶向递送，并实现了BDPM在肿瘤细胞内的可控释放，从而导致精确的肿瘤特异性ROS生成和细胞凋亡。同时，OMVs通过促进巨噬细胞复极化来增强抗肿瘤免疫。这种协同方法在减少脱靶毒性的同时，显著提高了治疗效果。总之，BDPM@OMVs代表了一种变革性的癌症治疗策略。通过整合靶向光动力治疗和免疫调节，该平台能够选择性地根除肿瘤，并为推进光动力免疫治疗领域开辟了新途径。
