《Journal of Food Composition and Analysis》：Dual-signal flow measurement immunoassay based on polydopamine-coated gold nanoparticles quenching quantum dots for the simultaneous detection of clorprenaline and zilpaterol
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本文为解决饲料中非法添加的瘦肉精（克伦特罗和齐帕特罗）残留快速检测难题，开发了一种基于聚多巴胺包覆金纳米颗粒（Au@PDA）猝灭量子点（QDs）的双信号免疫层析方法。该方法在15分钟内实现比色与荧光的双模式读出，检测灵敏度显著提升（齐帕特罗的荧光视觉检测限低至0.01 μg/L），并成功应用于猪肉和猪尿样本检测，为β2激动剂的现场快速筛查提供了强有力工具。
在追求更高效率和产量的畜牧业中，瘦肉精（β2激动剂类药物）曾被非法用作饲料添加剂，以促进动物生长、提高瘦肉率。然而，这类药物在动物体内残留后，会通过食物链进入人体，可能导致头痛、心悸、肌肉震颤乃至肢体麻痹等健康风险。因此，中国和欧盟等地区已明确禁止其使用。尽管如此，非法使用现象依然存在，对消费者健康构成潜在威胁。传统的检测方法，如高效液相色谱（HPLC）和液质联用（LC/MS-MS），虽然精准但需要昂贵仪器、专业操作和复杂的样品前处理，难以满足现场、快速、大规模的筛查需求。而常见的侧向层析免疫试纸条（胶体金法）虽便捷快速，但其灵敏度较低，在复杂样本基质（如肉、尿液）中易受干扰。因此，开发一种既快速简便，又足够灵敏、可靠的现场检测技术，成为保障食品安全的迫切需求。
针对这一挑战，中国计量大学生命科学学院的研究团队在《Journal of Food Composition and Analysis》上发表了一项创新研究。他们巧妙地将经典的胶体金比色信号与高灵敏的荧光信号相结合，构建了一种全新的双模式检测平台。其核心在于，他们不是简单地堆砌两种信号，而是设计了一种“此消彼长”的巧思：利用聚多巴胺包覆的金纳米颗粒（Au@PDA）作为高效的荧光猝灭剂。当试纸条T线上固定的捕获抗原捕获到带有抗体的Au@PDA探针时，探针会靠近并猝灭同样固定在T线上的量子点（QDs）发出的荧光；一旦样本中存在目标药物（克伦特罗或齐帕特罗），它们会与T线上的抗原竞争结合Au@PDA探针，使探针无法到达T线，从而解除猝灭，恢复荧光。这样，阳性样本在T线上表现为颜色变浅（比色信号减弱）和荧光显现（荧光信号增强），实现了双信号相互印证，显著提高了检测的可靠性和灵敏度。
为开展此项研究，作者主要运用了以下几项关键技术方法：首先，通过柠檬酸盐还原法合成金纳米颗粒（AuNPs），并利用过氧化氢辅助多巴胺氧化聚合，在其表面包覆聚多巴胺（PDA）壳层，制备Au@PDA纳米复合材料。其次，通过共价偶联将针对克伦特罗和齐帕特罗的单克隆抗体（mAb）分别固定在Au@PDA表面，构建免疫探针（Au@PDA-mAb）。同时，将量子点（QDs）与卵清蛋白（OVA）偶联，制备QDs-OVA复合物。然后，通过喷膜组装工艺，将捕获抗原（CLO/ZIL-BSA）、QDs-OVA以及羊抗鼠IgG（质控线）依次喷涂在硝酸纤维素（NC）膜上，并将Au@PDA-mAb探针喷在结合垫上，组装成双信号免疫层析试纸条。最后，利用该试纸条对加标的猪肉和猪尿样本进行检测，并采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法作为参比方法进行验证。
3.1. AuNPs和Au@PDA的表征
通过透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）分析证实，成功合成了平均核心直径约22纳米的球形AuNPs，并在其表面形成了均匀的PDA包覆层，形成核壳结构的Au@PDA。Au@PDA的水合动力学直径约为30纳米，抗体偶联后增大至约50纳米，且分散性良好。间接ELISA实验表明，Au@PDA的抗体偶联效率（CLO-mAb最高达95.9%，ZIL-mAb达93.3%）高于传统的AuNPs，这归因于PDA涂层上的醌基团能与蛋白质的巯基和氨基发生稳定的共价结合。
3.2. 反应机理探究
通过光谱分析发现，QDs的发射光谱（537纳米）与Au@PDA的紫外吸收光谱（541纳米）存在显著重叠，且两者的结合依赖于抗原-抗体的特异性识别。这满足了荧光共振能量转移（FRET）发生的条件。研究表明，观察到的荧光猝灭现象主要归因于Au@PDA纳米颗粒与QDs之间的FRET过程，内滤效应（IFE）可能起次要作用。
3.3. 免疫层析试纸条的优化
研究人员系统优化了检测体系的各个关键参数。包括PDA包覆厚度（确定2 μL DA·HCl为最佳）、抗体标记的pH值（CLO为15 μL K2CO3，ZIL为5 μL K2CO3）和抗体用量（CLO-mAb为20 μg，ZIL-mAb为15 μg）、T线喷涂的捕获抗原浓度（CLO-BSA为0.5 mg/mL，ZIL-BSA为0.3 mg/mL）、样品垫预处理配方（含Tris、去氧胆酸钠、表面活性剂S7和S9等的配方4）以及样本加样体积（90 μL）。此外，优化了荧光模式下T线上QDs-OVA的浓度，确定1 μmol/L为最佳。最终，确定免疫反应（检测）时间为15分钟。
3.4. 灵敏度测试
在最优条件下，该方法展现出卓越的灵敏度。在比色模式下，克伦特罗（CLO）和齐帕特罗（ZIL）的视觉检测限（vLOD）分别为5.00 μg/L和1.00 μg/L；而在荧光模式下，灵敏度大幅提升，vLOD分别达到0.10 μg/L和0.01 μg/L，相比比色模式分别提高了50倍和100倍。定量分析表明，CLO和ZIL在比色模式下的定量限（LOQ）分别为5.5 μg/L和1.2 μg/L，空白限（LOB）分别为0.56 μg/L和0.24 μg/L。
3.5. 特异性测试
测试了克伦特罗（CLO）、齐帕特罗（ZIL）以及其他五种类似物（CLE、RAC、SAL、TER、CIMB）。结果显示，只有CLO和ZIL阳性样本在T线上显示出明显的信号变化（比色带变浅和荧光带出现），而其他类似物均未产生明显信号，证明该方法对CLO和ZIL具有高度特异性。
3.6. 回收率实验
通过在猪尿和猪肉样本中进行加标回收实验来验证该方法的实际应用能力。回收率在80%至110%之间，变异系数为0.8%至12.5%。将检测结果与市售ELISA试剂盒进行对比，配对t检验显示在大多数浓度下无显著差异（p>0.05）。在猪肉样本中，该方法的荧光检测限（LOD）为CLO 1.5 μg/kg，ZIL 0.5 μg/kg；在猪尿样本中，荧光检测限为CLO 1.5 μg/L，ZIL 0.1 μg/L，展现出与ELISA可比甚至更优的灵敏度。
3.7. 双信号免疫层析试纸条的稳定性测试
3.7.1. 批次稳定性
使用五批独立合成的Au@PDA材料制备的试纸条进行检测，CLO和ZIL在比色和荧光模式下的变异系数（CV）均较低（CLO比色CV=1.79%，荧光CV=10.8%；ZIL比色CV=1.97%，荧光CV=4.63%），证明了该方法在材料合成、抗体标记和层析步骤方面具有良好的重现性。
3.7.2. 加速稳定性
将试纸条分别在45°C下储存一周和在37°C下储存90天以评估稳定性。结果显示，即使在90天时信号略有下降，但其检测性能依然保持稳定。根据阿伦尼乌斯方程（Arrhenius equation）推算，在37°C下储存90天（Q10=2）相当于在23°C下储存8个月，表明该试纸条在23°C下至少有8个月的保质期。
综上所述，这项研究成功开发了一种基于Au@PDA-QDs双信号免疫层析技术，用于同时检测克伦特罗（CLO）和齐帕特罗（ZIL）。该技术巧妙地将高稳定性的Au@PDA作为比色标记和荧光猝灭剂，与QDs荧光供体结合，通过FRET机制实现了比色和荧光的双信号输出。与传统的胶体金试纸条相比，其灵敏度得到极大提升，尤其是在荧光模式下。该方法操作简便（15分钟出结果）、灵敏度高、特异性好、稳定性强，并且在猪肉和猪尿等实际样本中验证了其准确性和可靠性。这项研究不仅为β2激动剂类“瘦肉精”的快速现场筛查提供了一种强有力的新型工具，其将纳米材料修饰、信号放大与双模式读出相结合的策略，也为开发面向其他小分子污染物的高灵敏、快速检测平台提供了新思路，在食品安全监测、环境分析乃至临床诊断等领域均展现出广阔的应用前景。
