《Journal of Hazardous Materials》：In Silico Design and Evaluation of Hybrid Antimicrobial Peptides for Combating Environmental Multidrug-Resistant Bacteria
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针对多药耐药菌挑战，本研究提出整合计算筛选与模块化杂交的新型策略。从生物控制菌株Bacillus velezensis 524B中提取自然短肽，经分类为阳离子（C）或亲脂性（H）模块后，通过CHCH框架系统组装，结合AMP_scanner计算筛选，成功获得高效抗多药耐药菌的CHCH_KRVL_3肽。该肽对Acinetobacter baumannii的MIC为8μM，选择性指数（SI）>10，杀菌机制涉及靶向磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰甘油（PG）引发膜渗透性破坏及持续ROS积累，同时具有显著抗生物膜活性，超过常规抗生素多粘菌素B。研究构建了"自然模块+CHCH骨架"的通用平台，为AI辅助加速抗微生物肽开发提供新范式。
黄海阳|盛琳娜|叶永利|孙家迪|季建|赵宏静|孙秀兰
江南大学食品科学与技术学院，食品安全国际联合实验室，食品安全与质量控制协同创新中心，中国江苏省无锡市214122
摘要
为应对多重耐药（MDR）细菌这一日益严峻的挑战，并克服传统抗菌肽（AMPs）的固有局限性——如结构不稳定和发现效率低下——我们提出了一种理性设计策略，将计算机模拟方法与模块化杂交技术相结合。从生物控制菌株Bacillus velezensis 524B中提取的天然短肽（4-6个氨基酸）被分类为阳离子模块或疏水模块，并使用一种新颖的CHCH（阳离子-疏水-阳离子-疏水）模块化杂交支架进行系统组装。候选肽通过AMP_scanner进行计算机筛选，最终确定了优化后的杂交肽CHCH_KRVL_3。该肽对多重耐药鲍曼不动杆菌表现出强烈的抗菌活性，最小抑菌浓度（MIC）为8μM，并具有较高的选择性指数（SI > 10）。机制研究表明，CHCH_KRVL_3通过特异性结合磷脂乙醇胺（PE）和磷脂甘油（PG）引发膜通透性瞬时增加，随后产生大量活性氧（ROS），从而发挥杀菌作用。此外，CHCH_KRVL_3在清除已形成的生物膜方面表现出优异性能，能够有效破坏PVC气管插管等临床相关表面的生物膜，其效果优于多粘菌素B。本研究不仅鉴定出一种先导化合物，还建立了一个可推广的“天然模块+CHCH支架”平台，利用人工智能辅助筛选加速未来抗菌肽的发现。
引言
日益严重的抗菌素耐药性全球危机迫切需要开发新的治疗手段。据预测，到2050年，多重耐药（MDR）感染每年将导致1000万人死亡，超过癌症成为主要死亡原因，因此创新解决方案的研制至关重要[1]。抗菌肽（AMPs）作为对抗MDR病原体的有力候选物质而受到关注[2]。AMPs通过破坏脂质双层并诱导细胞质渗漏来有效杀灭细菌，且不易引发耐药性，这一优势有助于遏制抗生素耐药基因（ARGs）的传播，成为应对环境ARGs污染问题的新治疗策略[3],[4]。
α-螺旋构象的形成是抗菌活性的关键决定因素，有助于与细菌膜相互作用并破坏其结构。Oliveira Júnior等人[5]系统综述指出，两亲性α-螺旋肽（如马加宁素）通过多种膜破坏机制（如环孔模型和地毯模型）来破坏膜完整性并发挥杀菌效果。然而，将天然α-螺旋AMPs转化为治疗药物的主要障碍在于抗菌效力与宿主细胞毒性之间的平衡[6]。为解决这一问题，理性设计杂交AMPs被证明是一种有效的优化策略，通过融合不同来源的功能模块来创造具有增强治疗效果的新化合物。例如，α-螺旋杂交肽YTP结合了稳定肽YW12D和免疫调节肽TP5，在免疫抑制小鼠模型中表现出更强的免疫调节活性，并将其血浆半衰期显著延长至超过2小时（而TP5仅为5分钟[7]）。另一种杂交肽BKR1由esculentin-1a和melittin组成，不仅对耐药菌株具有杀菌作用且不会引起溶血，还能与传统抗生素协同作用[8]。尽管这种方法取得成功，但它严重依赖专家直觉，且应用范围有限，通常仅结合两三个来源肽的大片段，从而限制了新肽的探索。
除了重组天然片段外，基于刚性模板（如（XXYY）?）的从头设计也为优化α-螺旋两亲性AMPs提供了新途径[9],[10]。这种方法确保了螺旋的疏水面和阳离子面的明确分离，这是决定抗菌活性和选择性的关键因素[11]。然而，刚性重复模板的局限性显著限制了设计空间和序列多样性[12],[13]。
为克服经验依赖的片段重组和限制性从头设计的局限，本研究引入了一种新颖且可扩展的AMP设计框架。我们的方法基于简单的CHCH模板（C=阳离子，H=疏水），将肽视为由功能模块组成的整体实体。核心创新在于将大量天然短肽库（如来自Bacillus velezensis 524B的肽库[14]）分解为其基本的阳离子（C）和疏水（H）模块。这种模块化组装策略结合了基于模板的系统设计与天然肽片段的丰富进化优化多样性，实现了快速、可编程的杂交肽库生成，大幅扩展了可探索的序列空间。重要的是，这些计算机生成的候选肽可以通过AMP_Scanner等成熟且广泛认可的预测模型进行高效筛选[16],[17]，为后续实验验证奠定了基础。这一综合策略不仅使AMP设计更加可行，还简化了整个发现流程。为了验证这一框架，我们构建了新型杂交肽CHCH_KRVL_3，它能有效对抗关键的MDR病原体（如鲍曼不动杆菌），最小抑菌浓度为8μM，并具有高选择性指数（SI > 10），证明我们的模块化组装策略能够成功平衡疗效与安全性。此外，机制研究揭示了明确的杀菌机制：肽首先作用于细胞膜导致快速去极化，随后触发ROS的大量产生。这一结果凸显了我们框架在生成新型抗菌肽方面的巨大潜力。
实验基本材料
本研究中使用的B. velezensis 524B菌株来自实验室保存的受污染小麦样本[14]。包括耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）ATCC 43300、敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）ATCC 29213、蜡样芽孢杆菌 ATCC 33019、单核细胞增生李斯特菌 ATCC BAA-751、革兰氏阴性大肠杆菌（E. coli）ATCC 25922、鼠伤寒沙门氏菌 ATCC 14028、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、氧孢克雷伯菌。真菌
524B天然短肽的组成和理化性质分析
对524B菌株产生的肽库进行统计分析后发现，肽的长度分布呈现明显规律：4-9个氨基酸的肽占61.4%，10-14个氨基酸的肽占24.4%，表明524B产生的大部分肽为短肽，仅有少数为长肽（例如，长度在78-83个氨基酸之间的肽仅占0.2%）（图1A）。关于氨基酸组成
讨论
抗菌肽开发中的一个核心挑战是平衡效力与稳定性。虽然肽杂交是一种有前景的策略，但现有方法存在显著局限性。一种常见方法是结合不同来源的大片段肽，如buferin II-desHDAP1杂交或P7A3[43],[44]。尽管这种方法有效，但它受到可用肽种类有限的限制
结论
总之，本研究建立了一种新颖高效的AMP设计框架，通过计算机辅助的CHCH模块化杂交策略系统利用天然短肽库。通过迭代优化（以提高预测的结构稳定性），我们获得了先导肽CHCH_KRVL_3。该肽对多重耐药鲍曼不动杆菌表现出强效抗菌活性（MIC = 8μM），具有良好的初步安全性（SI > 10），并在其他方面也表现出优异性能
CRediT作者贡献声明
孙秀兰：撰写——初稿撰写、监督、资源调配、项目管理、资金获取、概念构思。季建：监督、方法学设计。赵宏静：监督、方法学设计。黄海阳：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、可视化处理、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构思。孙家迪：监督、方法学设计。盛琳娜：监督、项目管理。叶永利：撰写——审稿与编辑、监督。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（32125031）、江苏省研究生研究与实践创新计划（KYCX25_2751）、中央高校基本科研业务费（JUSRP222001）以及江南大学食品安全与质量控制协同创新中心的财政支持。
