《Journal of Hazardous Materials Advances》：Analytical Techniques for Identifying Bacterial Communities in the Plastisphere: Advances and Challenges
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这篇综述系统性地梳理了识别塑料圈（plastisphere）——即塑料表面形成的独特微生物栖息地——中细菌群落的各类分析技术，从传统培养法到前沿的分子与成像方法。文章不仅对比了各种方法的分辨率、成本、通量等性能，还创新性地提出了一个将分类学、功能学与空间分析与危害评估终点（如病原体检测、抗生素耐药基因ARGs监测）相连接的工作流程，旨在为环境微生物学与风险评估交叉领域的研究者和监管者提供实用指南，提升研究的准确性、可重复性及对公共卫生风险的解读能力。
1. 引言
全球塑料产量的激增与低效的废物管理导致了塑料碎片在各类生态系统中累积的严峻环境危机。大型塑料碎片破碎后产生粒径小于5毫米的微塑料（MPs）。微塑料因其体积小、比表面积高，在环境中具有高度的迁移性和生物可利用性。尤为令人关切的是，微塑料可作为微生物定殖的基质，形成独特的“塑料圈”微生物群落。这些群落包含机会性致病菌和病原菌，能够形成具有抗逆性的生物膜，增强抗生素耐药性（AMR），并促进水平基因转移（HGT），从而构成了生态与公共健康风险。与天然基质不同，塑料表面惰性、疏水且难降解，这种选择压力有利于耐受压力的微生物和稀有类群的富集，使塑料圈成为抗生素耐药基因（ARGs）、污染物运输以及潜在健康风险的热点区域。尽管其重要性日益凸显，但方法学的局限性制约了我们对塑料圈相关微生物群落的表征能力。
2. 微塑料上的细菌群落与生物膜形成
塑料圈承载着复杂的微生物聚集体。其疏水、粗糙且易开裂的表面特性，为细菌细胞和有机颗粒的滞留提供了极为有利的环境，这些有机颗粒是重要的营养来源。这些表面还表现出强大的保留或吸附化学添加剂及环境污染物的能力，进一步促进了特定微生物类群的定殖。这使得塑料圈不仅支持机会性细菌的生长，还包括真菌、塑料降解菌和潜在病原体在内的多种微生物群。
生物膜的形成始于浮游细菌在微塑料表面的可逆附着，随后发展为永久性粘附，并形成包裹在细胞外聚合物（EPS）中的结构化微生物群落。成熟的生物膜具有多样的结构（如柱状菌落或具流体通道的类真菌网络），能优化营养流动，提供抵御环境压力的保护，并增强对抗菌剂的抵抗力。这些结构特征促进了微生物的存活，使微塑料成为在水生和陆地环境中运输具有抗逆性甚至致病性细菌的潜在载体。
组学研究表明，塑料圈生物膜会主动表达塑料降解酶、群体感应调节因子和多药外排泵，直接将生物膜的成熟与耐药性的出现联系起来。宏转录组证据也表明，与天然基质相比，与微塑料相关的群落中涉及群体感应和生物膜抗逆性的基因表达上调。此外，塑料圈环境支持了直接影响人类健康的病原菌（如大肠杆菌、克雷伯菌属、柠檬酸杆菌属、肠球菌属）的增殖，并促进了抗生素耐药基因（ARGs）的传播。
3. 塑料圈群落的环境持久性
紫外线（UV）辐射、温度波动和盐度梯度等环境因素显著影响微塑料上生物膜的组成、结构和抗逆性。高强度紫外线照射会降解塑料表面并改变微生物群落，通常有利于耐紫外线且耐受压力的类群。高温可能加速微生物代谢，促进快速定殖；而河口和海岸系统常见的极端盐度条件则会选择耐盐和渗透调节物种。
除了短期变化，塑料圈生物膜能够在水生和陆地环境中长期存留，其稳定性可持续数周至数月。这种持久性使塑料圈成为抗生素耐药基因（ARGs）和机会性病原体的储存库，增加了跨微生物类群水平基因转移的可能性。网络模型分析表明，塑料圈中的抗生素耐药基因携带类群与耐压微生物之间存在非随机关联，这提示塑料圈的抗逆性源于结构化的生态网络，而非随机定殖。持久性还受营养物质可用性、pH值以及有机污染物或重金属存在等物理化学条件的调节。
4. 微塑料表面细菌识别技术
理解细菌在微塑料表面的定殖对于识别与不同聚合物类型相关的微生物种类至关重要。尽管该领域近年来发展迅速，但整合现有知识、评估当前方法学并确定针对每种聚合物类型最有效的技术仍然非常重要。
评估用于识别微塑料相关微生物的技术不仅有助于提高方法学的准确性，还能评估每种方法的成本效益，这对于研究和环境监测中选择最可行且信息量最大的方法至关重要。
4.1 传统与培养方法
最基本的方法是培养法，即在特定营养培养基上培养微生物。表型和生化鉴定（如氧化酶和过氧化氢酶试验、革兰氏染色、API系统）常用于建立分离株的功能谱。虽然这些传统方法可用于初步鉴定，但其分类学分辨率有限，且无法检测微塑料上存在的大多数不可培养微生物。
4.2 分子技术
不依赖培养的分子技术通过检测无法在标准实验室条件下培养的类群，彻底改变了微塑料相关微生物群落的研究。
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16S rRNA基因扩增子测序：靶向细菌16S核糖体RNA基因的保守区域，通过与SILVA、Greengenes或RDP等参考数据库进行比较，可在属或种水平上进行分类学分析。其主要优势是能够同时检测可培养和不可培养的细菌，全面展示微生物多样性，但无法深入了解检测到的微生物的功能。
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鸟枪法宏基因组测序：无需预先扩增即可对样本中所有微生物DNA进行测序。与16S rRNA测序不同，它能同时提供分类学和功能学信息，包括与抗生素耐药性（ARGs）、代谢途径和塑料降解相关的基因。这种方法能够全面分析群落，并检测到新的或稀有的类群。
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定量PCR（qPCR）与高通量定量PCR（HT-qPCR）：常用于检测和量化塑料圈中的特定基因或微生物群。虽然qPCR无法提供微生物群落的完整概览，但其高灵敏度和特异性使其特别适用于监测与致病菌或ARGs相关的目标基因。HT-qPCR则可同时量化数百个微生物和耐药基因。
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荧光原位杂交（FISH）：使用荧光标记的探针，与完整细胞内的特定核糖体RNA序列结合，能够直接在微塑料上的生物膜中可视化微生物，提供关于微生物群落分布和组织结构的空间信息。与共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）结合时，可实现生物膜结构的3D重建。
4.3 显微成像技术
显微成像技术对于可视化定殖在微塑料表面的微生物群落的空间组织、形态和结构至关重要。
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共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）：常用于生成生物膜的高分辨率三维图像。通过应用区分活/死细胞或标记特定细胞成分的荧光染料，能够详细分析微塑料表面的生物膜结构和细胞活力。与FISH等分子探针结合，可将结构组织与微生物功能联系起来。
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扫描电子显微镜（SEM）：提供微生物定殖在微米和纳米尺度上的超微结构细节，可以高放大倍率和高分辨率观察细菌形态、细胞外聚合物（EPS）和微塑料的表面形貌。虽然无法进行物种鉴定，但对于确认生物膜形成和分析微生物与塑料表面的相互作用至关重要。
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原子力显微镜（AFM）：可提供生物膜的机械特性、粘附行为和纳米结构信息，揭示细菌在各种聚合物类型自然条件下的相互作用方式。
4.4 前沿分析技术
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单细胞基因组学：能够直接从微塑料中分离和测序单个微生物基因组，识别复杂塑料圈群落中的稀有或不可培养物种，并揭示其代谢潜能。
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稳定同位素探测（SIP）：通过掺入同位素标记的底物（如13C标记的聚合物），可以识别活跃的塑料降解微生物并追踪碳同化途径，对于研究塑料圈内的功能角色尤其有用。
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拉曼/傅里叶变换红外（FTIR）显微光谱：常用于确定微塑料聚合物的化学成分。与染色技术或FISH结合时，这些工具也能提供微生物定殖模式和聚合物特异性相互作用的见解。
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纳米二次离子质谱（NanoSIMS）：提供微生物细胞及其在塑料表面微环境的元素和同位素图谱，具有亚细胞空间分辨率，可用于详细研究微生物-塑料界面。
5. 挑战与局限性
尽管对塑料圈微生物学的兴趣日益增长，但识别与微塑料相关的细菌在方法学上仍面临挑战。
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培养技术：严重低估了微生物多样性，忽略了不可培养、生长缓慢或要求苛刻的微生物，且无法反映原位微生物群落的全部复杂性。
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分子技术：16S rRNA基因测序存在引物偏好性、PCR扩增误差，且高度依赖参考数据库的质量和完整性，可能导致某些类群的误分类或代表性不足。鸟枪法宏基因组学和宏转录组学成本高、计算量大，且通常需要从微塑料表面提取高质量、足量的核酸，而这可能会破坏生物膜的完整性。
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成像技术：FISH、SEM和CLSM等提供了宝贵的空间和形态学见解，但分类学分辨率有限，且需要复杂的样品制备和专业的技术知识。NanoSIMS尽管功能强大，但由于成本高、操作复杂而难以普及。
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标准化与可比性：微塑料采样、微生物DNA/RNA提取和数据归一化缺乏标准化方案，阻碍了不同研究之间的可重复性和可比性。环境异质性、聚合物特异性微生物亲和力以及环境抑制剂的存在进一步加剧了方法学的可变性。
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土壤特异性挑战：与水生环境相比，土壤塑料圈研究面临独特挑战。土壤微塑料通常形状、聚合物类型和风化程度更为异质。DNA吸附到粘土颗粒上以及腐殖质的共提取会抑制PCR扩增和测序。土壤微塑料回收的微生物生物量通常较低，这给鸟枪法宏基因组学等需要大量核酸输入的高通量技术带来了挑战。
6. 讨论
塑料圈研究的一个关键挑战是将方法学进展转化为与危害相关的见解。不同的技术不仅在分辨率和成本上存在差异，而且其解决特定公共卫生和环境健康相关问题的能力也不同。
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技术与危害终点的对接：16S rRNA测序适用于群落组成的广泛调查，但提供有关活力或功能风险的信息有限。鸟枪法宏基因组学能够检测抗生素耐药基因（ARGs）、毒力因子和代谢途径，直接将分类学数据与功能危害联系起来，但其成本和计算需求限制了常规应用。qPCR和数字PCR（dPCR/ddPCR）即使在低生物量的塑料圈样本中也能高灵敏度地检测ARGs和病原体标记物，对于监测和监管尤其有价值。宏转录组学和RNA检测能提供活跃微生物种群的证据，这对于区分潜在风险（存在ARGs或病原体）和已实现风险（活跃表达的耐药性或毒力基因）至关重要。FISH-CLSM、拉曼-FISH和NanoSIMS等空间分辨方法使研究人员能够在微米到纳米尺度上可视化微生物聚生体的组织、ARGs和质粒的共定位以及微生物-塑料相互作用。
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数据整合与统计挑战：结合宏基因组学、宏转录组学、代谢组学和成像的多组学方法产生了复杂的多层数据，需要先进的统计框架。机器学习分类器正被应用于从宏基因组特征预测抗生素耐药基因（ARGs）和致病类群的存在。然而，不同组学平台之间的归一化仍然不一致，导致土壤、沉积物和水生塑料圈研究之间的比较存在偏差。开发稳健的计算流程、采用通用元数据标准以及通过多中心数据集验证模型对于提高可重复性和生态学解读至关重要。
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迈向标准化与工作流程：为增强可比性和可重复性，塑料圈研究报告应至少包含：质量控制/质量保证（QA/QC）措施、元数据字段、报告清单，并尽可能结合至少一种分类学、一种功能学和一种活力/空间方法，以确保产出与危害相关。
采用这种整合的工作流程，研究者可以将方法选择与危害关注终点（如ARGs监测、病原体检测、活力评估和生态暴露评估）对齐，从而推动塑料圈研究超越描述性的分类学调查，产生可为监管者和风险管理者提供信息、可操作的数据。
7. 结论
尽管分析技术发展迅速，但塑料圈相关细菌群落的研究仍面临重要局限。培养法低估了多样性，而测序和成像方法尽管功能强大，却受限于偏好性、成本和技术专长。应对这些挑战需要协调的策略，以整合分类学、功能学和空间信息，同时确保跨实验室的可重复性。
基于本综述的综合分析，我们为未来塑料圈研究提出以下实用建议：
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采用整合的工作流程，结合互补的方法（例如，用于群落组成的16S rRNA测序，用于ARGs的qPCR/dPCR，以及用于生物膜验证的FISH/CLSM），以生成与危害相关的产出。
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实施QA/QC标准，包括现场和试剂空白、无塑料耗材以及内标对照，以最大限度减少污染并提高可比性。
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确保透明的元数据报告，涵盖聚合物类型、样本来源、提取方案、测序平台和数据库版本。
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制定与现有微生物组和环境微生物学标准相一致的报告清单，并适应塑料圈特有的挑战。
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通过鼓励在常规监测中使用qPCR或HT-qPCR等经济有效的方法，同时保留宏基因组学和成像平台用于针对性研究，来促进可及性和能力建设。
此外，建议采用经过土壤微塑料验证的标准化DNA/RNA提取试剂盒、用于ARGs交叉验证的标准化生物信息学流程，以及适用于土壤环境的原位多模态成像技术。应优先开展协调的多中心比对试验，以建立可重复性并加强塑料圈研究的生态学和监管相关性。
通过将方法选择与抗生素耐药性监测、病原体活力和暴露评估等危害关注终点对齐，塑料圈研究可以从描述性调查转向为环境监测和监管框架提供可操作的数据。
