《Advanced Science》：Polydopamine-Encapsulated Probiotics Restore Gut Homeostasis and Reinstate Macrophage Efferocytosis in Systemic Lupus Erythematosus
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本研究开发了一种聚多巴胺（PDA）包封的鼠李糖乳杆菌GG（LGG@PDA），作为一种生物工程益生菌平台，通过调节肠道微生物群和恢复巨噬细胞胞葬（efferocytosis）功能，有效治疗系统性红斑狼疮（SLE）。文章揭示了LGG@PDA通过提高益生菌在胃肠道中的存活与定植，重塑肠道菌群，并富集关键代谢产物L-甲硫氨酸，进而以CX3CR1依赖性方式增强巨噬细胞的胞葬能力，最终改善SLE的疾病表型，为基于肠道微生物群的SLE治疗提供了新策略。
系统性红斑狼疮与肠道微生物群失调
系统性红斑狼疮（SLE）是一种以免疫失调和慢性炎症为特征的自身免疫性疾病。近年来，越来越多的证据表明肠道微生物群（gut microbiota）在其发病机制中扮演了关键角色。在SLE患者和狼疮易感小鼠中，肠道菌群失调（dysbiosis），包括微生物多样性减少和促炎类群富集，是常见的病理特征。这种失调可能破坏肠道屏障完整性并改变代谢产物输出，从而维持系统性免疫激活并损害免疫耐受。因此，调节肠道生态系统，例如通过补充益生菌（probiotics），成为一种有前景的治疗策略。
常规益生菌疗法的局限性及LGG@PDA的构建
在众多益生菌中，鼠李糖乳杆菌GG（Lactobacillus rhamnosus GG， LGG）因其临床安全性及免疫调节特性展现出潜在治疗价值。然而，常规益生菌疗法在恶劣的肠道环境中存活率低、定植能力差，限制了其疗效。为了克服这些挑战，本研究开发了一种聚多巴胺（polydopamine， PDA）包封的LGG（LGG@PDA）。PDA是一种具有良好生物相容性、pH响应性和抗氧化特性的生物启发聚合物。研究通过优化包封条件，发现使用1.0 mg mL?1盐酸多巴胺时，可在LGG表面形成均匀连续的PDA层，有效增强其耐受胃肠道恶劣环境的能力。表征结果显示，LGG@PDA的粒径增大，表面电位发生渐进性变化。在体外，与未经包封的LGG相比，LGG@PDA对模拟胃液和肠液具有更强的耐受性，且不影响其生长速率和活性。体内追踪实验进一步证实，Cy5标记的LGG@PDA在胃肠道中的停留时间显著延长，定植数量更高。此外，LGG@PDA还被证实能有效清除巨噬细胞内的活性氧（ROS），显示出双重保护作用。
LGG@PDA在狼疮模型中的治疗疗效
研究首先在普里斯特烷（pristane）诱导的狼疮样小鼠模型中评估了LGG@PDA的治疗效果。实验设计为：在狼疮诱导一个月后，小鼠被随机分配，接受生理盐水、游离LGG或LGG@PDA的口服给药。结果显示，LGG@PDA治疗能显著改善疾病进展，具体表现为减少尿蛋白排泄，降低血清抗双链DNA（anti-dsDNA）抗体和抗核抗体（ANA）水平。同时，治疗也减轻了脾肿大和淋巴结肿大。免疫细胞分析发现，LGG@PDA给药显著降低了脾脏中Th17细胞、滤泡辅助性T细胞（Tfh）、抗体分泌B细胞（ASCs）和浆母细胞的频率，同时促进了调节性T细胞（Treg）的分化。在肾脏病理方面，LGG@PDA治疗显著减少了肾小球中的炎症浸润，保留了正常的肾小球结构，并降低了IgG和C3的沉积。
为在慢性自发模型中验证这些发现，研究进一步在MRL/lpr自发性狼疮易感小鼠中进行了评估。LGG@PDA治疗改善了小鼠的生存率，降低了尿蛋白、抗dsDNA抗体和ANA水平，并减轻了脾脏和淋巴结重量。脾脏免疫细胞分析显示，Th17细胞、Tfh细胞、ASC和浆细胞频率降低。肾脏组织病理学评估同样显示肾小球结构得到保留，炎症浸润减少，且肾小球中IgG和C3沉积减弱。这些结果表明，LGG@PDA在诱导和自发两种狼疮模型中均具有强大的免疫调节和肾脏保护作用。
LGG@PDA改善肠道氧化应激、重建黏膜免疫平衡与屏障完整性
鉴于肠道氧化应激、免疫失调和屏障功能障碍在驱动系统性自身免疫中的关键作用，研究考察了LGG@PDA对肠道ROS动态、黏膜免疫细胞群和上皮屏障完整性的局部影响。免疫荧光染色显示，LGG@PDA治疗显著降低了肠道中的ROS水平。对固有层淋巴细胞的流式细胞术分析表明，LGG@PDA治疗显著降低了CD4+T细胞中Th17细胞的比例。此外，LGG@PDA显著减少了固有层巨噬细胞，特别是产生肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的巨噬细胞频率。根据CX3CR1表达进行的亚群划分显示，LGG@PDA促进了巨噬细胞从促炎的CX3CR1low/int亚群向组织驻留的CX3CR1hi亚群转变。最后，LGG@PDA还通过上调紧密连接相关基因（ZO-1、Occludin、Claudin-4和Claudin-23）及其蛋白的表达，恢复了肠道上皮屏障的完整性。
LGG@PDA重塑肠道菌群结构并增强微生物多样性
通过16S rRNA基因测序分析普里斯特烷诱导狼疮小鼠的肠道菌群，发现狼疮小鼠的Chao1和Shannon指数显著降低，表明微生物丰富度和多样性减少。而LGG@PDA给药恢复了微生物多样性，使其接近健康对照水平。基于加权UniFrac距离的主坐标分析（PCoA）显示，LGG@PDA治疗组小鼠的微生物群与健康对照组聚类更接近。在门水平上，LGG@PDA显著增加了厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度，同时减少了拟杆菌门（Bacteroidetes）的丰度，从而提高了厚壁菌门/拟杆菌门（F/B）比率。在属水平上，LGG@PDA降低了Muribaculaceae、Clostridia_vadinBB60_group和Ileibacterium的相对丰度，同时富集了被认为对肠道稳态有益的Lachnospiraceae_NK4A136_group、Alloprevotella和Roseburia。线性判别分析效应大小分析进一步鉴定出能区分不同组别的关键微生物类群。
LGG@PDA重编程粪便代谢物并恢复胞葬作用
鉴于肠道菌群在塑造宿主代谢输出中的核心作用，研究对粪便样本进行了非靶向代谢组学分析。结果显示，LGG@PDA治疗导致粪便代谢谱发生显著改变。在阳离子模式下，L-甲硫氨酸（L-methionine）、DL-脯氨酸、鞘氨醇、烟酸等是最丰富的上调代谢物；而胆碱、硫酸盐、大豆苷元等是主要的下调代谢物。正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）证实了处理组与对照组的明显分离。对差异代谢物的KEGG通路富集分析显示，上调的代谢物主要富集在半胱氨酸和甲硫氨酸代谢通路以及胞葬通路中。
胞葬（efferocytosis）是吞噬细胞清除凋亡细胞的过程，对维持免疫耐受和组织稳态至关重要。研究评估了LGG@PDA恢复狼疮小鼠巨噬细胞胞葬功能的能力。流式细胞术分析表明，LGG@PDA给药促进了巨噬细胞向M2表型极化。在体内胞葬实验中，LGG@PDA治疗小鼠的腹膜巨噬细胞对CypHer5E标记的凋亡Jurkat细胞的吞噬能力显著增强。组织学检查也显示，LGG@PDA治疗小鼠肾脏中未清除的凋亡细胞积累减少。为了进一步探究肠道菌群是否有助于恢复胞葬功能，研究使用广谱抗生素耗竭了小鼠的肠道微生物。结果显示，抗生素治疗显著破坏了巨噬细胞的胞葬功能，而补充LGG@PDA则有效恢复了该功能，表明肠道来源的信号可以影响胞葬的系统性调节。
L-甲硫氨酸：连接肠道菌群重塑、胞葬与狼疮改善的关键代谢介质
为探究代谢物重编程及其影响狼疮发病机制的潜在机制，研究对狼疮临床表型、肠道菌群组成和粪便代谢物进行了相关性分析。结果显示，L-甲硫氨酸的水平与狼疮的严重程度，如蛋白尿、抗dsDNA抗体、ANA水平及肾脏病理呈显著负相关，同时与腹膜M2巨噬细胞频率呈正相关。此外，L-甲硫氨酸和蓖麻酸甲酯这两种代谢物的丰度与厚壁菌门和拟杆菌门的丰度变化相关。通过维恩图分析，L-甲硫氨酸被鉴定为连接半胱氨酸/甲硫氨酸代谢通路、胞葬通路、肠道菌群和狼疮临床特征的枢纽代谢物。重要的是，在SLE患者中检测血清L-甲硫氨酸水平，发现其显著低于健康对照，这与狼疮小鼠中的发现一致。
功能实验表明，在抗生素耗竭肠道菌群后，补充外源性L-甲硫氨酸能有效恢复受损的巨噬细胞胞葬功能。为了阐明L-甲硫氨酸调节胞葬的分子机制，研究对RAW264.7巨噬细胞进行L-甲硫氨酸剥夺和补充处理，并检测了一系列经典胞葬相关基因的表达。结果显示，在所有检测的基因中，仅有CX3CR1的表达在L-甲硫氨酸剥夺时下调，在补充时恢复。流式细胞术进一步证实，L-甲硫氨酸剥夺显著降低了巨噬细胞CX3CR1的表达，而补充则恢复了其表达。在人CD14+单核细胞来源的巨噬细胞中也观察到了CX3CR1受L-甲硫氨酸调控的保守现象。
鉴于CX3CR1是一种识别凋亡细胞释放的“来找我”信号CX3CL1的趋化因子受体，研究进一步探讨了CX3CR1是否介导了L-甲硫氨酸对胞葬功能的影响。体外实验发现，L-甲硫氨酸补充恢复了巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬能力，而使用选择性拮抗剂JMS-17-2阻断CX3CR1则消除了这种恢复效应。体内实验也证实，CX3CR1拮抗剂损害了健康小鼠腹膜巨噬细胞的胞葬能力，而L-甲硫氨酸对胞葬功能的恢复作用同样被CX3CR1抑制所阻断。
基于上述机制发现，研究评估了补充外源性L-甲硫氨酸对狼疮疾病结局的影响。在普里斯特烷诱导的狼疮小鼠中，补充L-甲硫氨酸显著增强了腹膜巨噬细胞的胞葬能力，降低了抗dsDNA抗体水平和尿蛋白排泄，增加了外周血巨噬细胞CX3CR1的表达。随着持续治疗，这些免疫学改善进而显著减轻了肾脏免疫复合物的沉积和肾脏病理。这些发现共同支持了微生物来源的L-甲硫氨酸通过上调CX3CR1表达来恢复巨噬细胞胞葬功能，从而抑制狼疮进展的作用机制。
结论
本研究构建了一种具有增强细菌活性、黏附和抗氧化能力的生物工程化LGG@PDA，用于SLE的治疗。在狼疮小鼠模型中，LGG@PDA通过降低自身抗体水平、改善肾脏病理、恢复肠道和免疫稳态以及增强巨噬细胞胞葬作用来缓解疾病表型。从机制上讲，这些效应与微生物来源的L-甲硫氨酸相关，后者通过上调CX3CR1表达促进巨噬细胞胞葬，从而在肠道微生物代谢与系统性免疫调节之间架起桥梁。综上，LGG@PDA作为一种有前景的基于益生菌的SLE干预策略，揭示了L-甲硫氨酸-CX3CR1轴是连接肠道代谢与免疫稳态的关键机制。
