环糊精-铁载体缀合物：一种用于细菌靶向的“特洛伊木马”策略

《Journal of Inorganic Biochemistry》：Cyclodextrin–siderophore conjugates as a Trojan horse strategy for bacterial targeting

利用细菌铁获取系统增强抗生素疗效，本研究合成环糊精（β-CD）与铁螯合剂（脱氧铁胺、鞣酸）的缀合物，作为多西环素的载体。结果表明，脱氧铁胺缀合的环糊精使多西环素对大肠杆菌的最低抑菌浓度提高4倍，验证了该递送系统的有效性。

　　

Chiara Ragusa | Roberta Panebianco | Vinceenzo Paratore | Guglielmo Guido Condorelli | Kaveh Eskandari | Douglas Robinson | Fraser J. Scott | Rosanna Inturri | Maria Serena Rossitto | Valentina Giglio | Graziella Vecchio

卡塔尼亚大学化学科学系，意大利卡塔尼亚，A. Doria大道6号，95125

摘要

抗生素耐药性的增加需要开发创新策略来提高现有治疗方法的有效性。一种有前景的方法是利用细菌的铁摄取系统，通过基于铁载体的药物递送来增加细胞内的药物浓度，这是一种“特洛伊木马”策略。我们合成了新的环糊精与铁载体（如去铁胺和没食子酸）的 conjugates，以利用环糊精在“特洛伊木马”策略中的药物包封能力。这些新型衍生物被研究作为 大肠杆菌 和 金黄色葡萄球菌 中的多西环素载体。值得注意的是，环糊精-去铁胺衍生物显著提高了多西环素的效果，其对 大肠杆菌 的最小抑菌浓度提高了4倍。

引言

抗生素耐药性对公共卫生构成了日益严重的威胁。然而，由于高昂的成本、漫长的临床试验时间以及高失败率，开发新药物具有挑战性[[1], [2], [3]]。因此，研究重点在于改进现有抗菌药物的有效性 [2,[4], [5], [6]]。

靶向药物递送在对抗细菌感染方面已被证明是有效的，为克服由细胞壁通透性介导的细菌耐药性提供了一些希望 [7]。

最有前景的研究领域之一是利用细菌的铁摄取系统。这种“特洛伊木马”方法基于劫持通过铁载体受体的铁摄取机制，可以增加小分子和大分子治疗药物的细胞内浓度 [7]。

在过去的几十年中，已经使用不同的连接剂和铁载体类型设计了几种铁载体-抗生素 conjugates (SACs) [8]。在某些情况下，合成了合成铁载体。一些分子已经进行了药物发现并进入了临床前和临床试验。一个成功的例子是 cefiderocol（商品名 FeTroja，图 1），它于2019年获得了美国食品药品监督管理局 (FDA) 的批准，用于治疗尿路感染，2020年获得了用于医院内和呼吸机相关细菌性肺炎的批准 [9]。此外，它还作为第二阶段临床试验的一部分，用于评估疑似或确诊的需氧革兰氏阴性菌感染的儿科住院患者的安全性、耐受性和药代动力学 [10]。Cefiderocol 通过铁载体转运蛋白展示了一种创新的细胞进入机制，并能克服 β-内酰胺酶的耐药性。它在体外对广泛的临床重要革兰氏阴性病原体表现出卓越的效果，包括多重耐药菌株 [11]。Cefiderocol 含有儿茶酚单元，可以形成被铁转运蛋白通道识别的铁 (III) 复合物，从而增强其进入细菌的能力 [12]。

在最常用的天然铁载体中，儿茶酚 [3,13]、去铁胺 B [14,15] 和肠杆菌素 [16] 已被结合到抗生素上 [3,8,13,15,[17], [18], [19]]。

去铁胺 B (DFO) 是一种天然存在的三羟基氨基酸铁载体，由属于 链霉菌 属的不同物种（如 S. pilosus、S. coelicolor 和 S. griseus）广泛产生，这要归功于 desABCD 基因簇 [20]。在铁离子存在下，DFO 形成六配位的铁复合物。它还用于治疗铁过载疾病，如 β-地中海贫血和血色素沉着症，以及铝中毒 [21]。此外，DFO 还因其神经保护作用而被研究，例如在阿尔茨海默病等疾病中，铁积累可能导致神经退化 [22]。

DFO 也可以与镓 (III) 形成复合物。最近的一项研究表明，聚合物 DFO conjugates 的镓复合物可以通过铁摄取系统被细菌吸收，并在体外和体内增强万古霉素对革兰氏阴性细菌（如 P. aeruginosa）的抗菌活性 [23,24]。

没食子酸 (3,4,5-三羟基苯甲酸，GA) 是一种生物多酚，含有在天然儿茶酚铁载体中负责 Fe(III) 螯合的关键儿茶酚部分 [8,25]。GA 已被证明可以抑制细菌生物膜的形成 [26]。GA 具有许多生物活性 [25]，并且已被结合到生物分子上，赋予抗菌和抗癌特性 [27,28]。

基于对 SACs 的兴趣，我们探索了基于环糊精化学的非共价“特洛伊木马”方法。与非共价方法相比，非共价药物递送系统具有许多优势，如灵活性、可逆性和降低毒性 [29,30]。

环糊精 (CDs) 是由 α-1,4-糖苷键连接的葡萄糖单元组成的环状寡糖。它们截短的圆锥形状和内部空腔使它们能够与多种分子形成包封复合物 [31]。

由于这些特性，CDs 在制药应用中被广泛用于提高药物的溶解度、稳定性、感官特性和生物利用度 [32,33]。值得注意的是，CDs 及其衍生物具有低毒性和低免疫原性，并已被证明是特别有效的药物递送系统，可以改善药物的治疗效果和安全性 [32]。目前，市场上有超过五十种基于 CD 的制剂，用于各种治疗活动，包括抗生素如头孢噻胺、头孢地托伦、吡伏沙星和诺氟沙星 [34]。

在这项研究中，我们将 DFO 或 GA 与 β-CD 结合，分别形成 CDDFO 和 CDGA（图 1）。CD 可以作为药物的结合位点。结合到 CD 结构中的 DFO 或 GA 单元可以与 Fe³⁺ 形成复合物，随后通过 UV–Vis 光谱和 ESI-MS 光谱进行表征。CDGA 和 CDDFO 的铁复合物可能通过特定的铁摄取通道被细菌内化。

新的铁载体 CD conjugates 也在两种参考细菌菌株中作为新型多西环素 (DX) 载体进行了测试。分别测定了 DX 单独存在以及与铁载体 CDGA 和 CDDFO 共存时的最小抑菌浓度 (MIC)，针对 大肠杆菌（一种革兰氏阴性细菌）和 金黄色葡萄球菌（一种革兰氏阳性细菌）。大肠杆菌 和 金黄色葡萄球菌 可以利用多种外源性铁载体，包括 DFO [35,36]。

DX 是一种广谱四环素抗生素，用于控制和治疗皮肤、牙周和性传播感染、疟疾和莱姆病；它还对霍乱、支原体病、兔热病、伤寒和立克次体病等疫情有效 [37]。

DX 与 β-CD 和羟丙基-CD 的包封复合物已被广泛研究 [[38], [39], [40]]。据报道，DX-β-CD 制剂可以提高光稳定性并改善药物性能 [31,32]。在一些国家，含有多西环素作为 β-环糊精包封复合物的药品制剂已在市场上销售。这些制剂（商品名 Doxydan、Doxid Plus、Doxirite、Cyclidox）被临床用作广谱抗菌剂。

章节片段

化学品

除非另有说明，否则直接使用市售试剂。Mono-6-O-(p-甲苯磺酰)-β-环糊精 (CDTos) 和 6-单氨基-6-脱氧-β-环糊精 (CDNH₂) 从 Cyclodextrin-Shop 购买。1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺 (EDC)、DFO 酯甲酯、三乙胺和二甲亚酰胺从 Sigma-Aldrich 购买。没食子酸、1-羟基苯并三唑 (HOBt) 和多西环素盐酸盐 (DX) 从 Tokyo Chemical Industry (TCI) 购买。

TLC（薄层色谱）

结果与讨论

GA 和 DFO 在 β-CD 的初级边缘处进行了 conjugation。CDDFO 衍生物通过 DMF 中的亲核取代反应从 CDTos 合成（图 S1）。CDGA 通过从 CDNH₂ 和 GA 开始的缩合反应合成，使用 HOBt 和 EDC 作为活化剂（图 S2）。衍生物的 NMR 光谱通过 COSY、TOCSY、HSQC 和 ROESY 光谱进行归属。

在 CDDFO 的 ¹H NMR 光谱（图 2, S3–S6）中，除了典型的 CD 质子信号外，还出现了 DFO 的质子信号

结论

我们合成了与铁载体系统（如去铁胺和没食子酸）结合的 β-环糊精 conjugates。这些 CD 衍生物形成的铁 (III) 复合物可以作为细菌中多西环素的载体。

用去铁胺修饰的环糊精提高了缺铁培养基中多西环素的抗菌活性，使 DX 对 大肠杆菌 的 MIC 相比单独使用多西环素提高了4倍。未发现环糊精本身有类似效果

CRediT 作者贡献声明

Chiara Ragusa：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学，数据管理。 Roberta Panebianco：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，验证，研究，数据管理。 Vincenzo Paratore：撰写 – 原稿，研究，数据管理。 Guglielmo Guido Condorelli：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学，数据管理。 Kaveh Eskandari：方法学，研究，数据管理。 Douglas Robinson：验证，

未引用的参考文献

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利益冲突声明

作者声明他们没有可能影响本手稿报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢欧盟在 NextGenerationEU-MUR PNRR Extended Partnership on Emerging Infectious Diseases 项目（项目编号 PE00000007, INF-ACT）中的资助。DR 由 Medical Research Scotland（PHD-50237-2020）资助。