CD68 被确定为人类黑色素细胞发育和功能的调节因子

《Journal of Investigative Dermatology》：CD68 Identified as a Regulator of Human Melanocyte Development and Function

CD68调控黑色素生成及细胞增殖的机制研究通过hESC分化模型结合单细胞RNA测序，发现CD68与MITF、TYR等核心基因协同表达，敲低CD68显著抑制黑色素合成及细胞增殖，揭示其作为黑色素生成调控网络新成员的功能。

　　

刘亚婷|曾宣浩|黄世毅|金一婷|臧青|陈家旺|连伟林|沈佳毅|王金奇|吕浩珍|徐金华|张琦

复旦大学华山医院皮肤科，中国上海200040

摘要

本研究证实了CD68（传统上被认为是巨噬细胞的标志物）在黑色素细胞生物学中的调控作用。我们利用人类胚胎干细胞（hESC）分化模型来模拟神经嵴来源的黑色素细胞发育过程，并在五个关键发育时间点（第0天、第6天、第9天、第11天和第25天）进行了单细胞RNA测序，从而构建了黑色素细胞分化的全面转录图谱。通过应用单细胞定向追踪（SOT）算法，发现CD68是黑色素生成过程中的一个先前未被认识的组成部分，其表达与MITF、TYR和TYRP1等核心调控因子协调一致。功能验证表明，敲低CD68会显著影响黑色素的合成、细胞增殖以及MAPK通路的激活。这些发现重新定义了CD68的生物学意义，使其超越了其与免疫细胞的经典关联，揭示了CD68作为黑色素生成调控网络组成部分的角色。这项工作为理解黑色素细胞发育提供了重要见解，并指出CD68可能是治疗色素性疾病的潜在靶点。

引言

黑色素细胞是起源于神经嵴的色素生成细胞，分布于皮肤、毛囊、眼睛、内耳和大脑中（Brito和Kos，2008；Brombin和Patton，2024；Gudjohnsen等人，2015；Tachibana，1999；Yajima和Larue，2008）。位于真皮-表皮交界处的表皮黑色素细胞合成黑色素并将其传递给邻近的角质形成细胞，从而决定皮肤的色素沉着（Lin和Fisher，2007）。这一过程有助于抵御紫外线和氧化应激（Dilshat等人，2021），其失调会导致色素性疾病的产生。

黑色素细胞起源于胚胎发生过程中从神经板迁移而来的神经嵴细胞。这些前体细胞经历一系列分化过程，最终成熟为具有色素生成能力的黑色素细胞（Pan和Thomson，2007）。目前的研究已经确定了超过250个参与人类色素调节的基因（Gaudel等人，2020）。主要调控因子MITF控制着黑色素生成酶（TYR、TYRP-1、DCT）的表达，这些酶对黑色素合成、黑色素小体形成和色素运输至关重要（Goding和Arnheiter，2019；Vachtenheim和Borovansky，2010）。

我们开发了一种基于人类胚胎干细胞（hESC）的分化模型，该模型能够再现神经嵴来源的黑色素细胞发育过程（Wang等人，2021），从而识别出黑色素细胞分化和功能的调控因子。我们在hESC分化为黑色素细胞的五个关键时间点（第0天、第6天、第9天、第11天和第25天）进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，构建了描述黑色素细胞完整分化轨迹的全面转录图谱。通过应用单细胞定向追踪（SOT）算法（Guo等人，2019）分析scRNA-seq数据，我们发现了在黑色素生成过程中协同表达的基因网络，其中CD68表现出显著的上调，并与MITF等关键黑色素生成调控因子表现出协调变化。

CD68是一种溶酶体膜糖蛋白，作为单核吞噬细胞系统（包括巨噬细胞、单核细胞及其前体）的公认标记物（Chistiakov等人，2017）。尽管已有报道指出小鼠内耳中存在一种特化的巨噬细胞样黑色素细胞群体表达CD68（Zhang等人，2012），但其表达模式、调控机制以及在皮肤黑色素细胞中的功能作用仍需进一步研究。本研究阐明了CD68在皮肤黑色素细胞发育和功能中的作用，为深入理解黑色素细胞生物学提供了理论依据。

实验方法

胚胎干细胞衍生的黑色素细胞（ESMC）的分化

如“方法”部分所述，我们采用了Mica等人报道的方法来诱导胚胎干细胞向黑色素细胞分化（Callahan等人，2016；Mica等人，2013）。用于指导胚胎干细胞向黑色素细胞分化的逐步方案示意图见补充图S1。在倒置相衬显微镜下观察并记录了胚胎干细胞分化为黑色素细胞过程中的每日形态变化。

讨论

本研究表明，传统上被认为是单核细胞-巨噬细胞谱系标志物的CD68在人类表皮黑色素细胞中高表达，并在功能上调控黑色素生成过程。通过结合单细胞转录组分析及功能验证，我们发现CD68的表达与黑色素细胞的成熟过程同步，并与TYR、TYRP1、MITF等关键黑色素生成基因协同作用。敲低CD68会显著影响黑色素细胞的生物学过程。

细胞培养

本研究使用的人类胚胎干细胞H9（ESC）（目录编号：SCSP-307）（https://cellbank.org.cn/search-detail.php?id=636）和人类诱导多能干细胞（iPSC）DYR0100（目录编号：SCSP-1301）（https://cellbank.org.cn/search-detail.php?id=487）由中国科学院细胞库/干细胞库提供。人类胚胎干细胞被接种在涂有Matrigel（Corning，美国）的T25培养皿中，培养基为mTeSR? Plus。

伦理声明

皮肤组织样本和人类来源的细胞培养物均来自自愿捐赠者，捐赠者事先签署了书面知情同意书。本研究已获得复旦大学伦理委员会的批准（KY2021-011），并遵循《赫尔辛基宣言》进行。

数据可用性声明

与本研究相关的数据集可访问：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA644879，访问编号：PRJNA644879。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

作者贡献

所有作者均参与了本研究。概念设计：QZ、XZ；资金获取：QZ、JX；实验研究：YL、XZ、SH、QZ、JC、WL、JS；项目管理：QZ、JX、YJ；初稿撰写：YL、XZ、SH、JW；修订与编辑：QZ、HL。

人工智能（AI）和大型语言模型（LLM）声明

本稿的撰写过程中未使用任何AI或LLM工具。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（2024YFA1108404）、国家自然科学基金（82273562、82073465、81671550）、上海市卫生健康和计划生育委员会（编号2023ZZ02018）、上海市重点临床专科（编号shslczdzk01002）、上海市科学技术委员会（编号21140900800、20DZ2202200、20Y11905500）、上海市毛发医学研究中心（编号19DZ2250500）以及SHDC临床研究计划的支持。