《Allergy》：Successful Application of the Mast Cell Activation Test in Immediate Hypersensitivity to Amoxicillin
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本文评估了一种利用CD34+源性肥大细胞进行体外诊断的新方法。通过引入优化的培养条件（如TSLP、IL-33）和工程化抗原（G4/G5-AXO树枝状结合物），该肥大细胞活化试验（MAT）在诊断阿莫西林速发型过敏反应中展现了出色的性能。其将不同抗原刺激（游离AX与AXO-树枝状结合物）相结合的策略，覆盖了患者异质性的IgE反应谱，实现了高灵敏度（75%）与高特异性（100%），为β-内酰胺抗生素过敏的精准诊断提供了有力的补充工具。
引言
全球抗生素消费量持续增长，其中β-内酰胺类（BLs），尤其是青霉素类，使用最为广泛。这导致了较高的速发型药物过敏反应（IDAR）发生率，其中阿莫西林（AX）是引起IgE介导反应最常见的药物之一。然而，高达90-95%的“青霉素过敏”标签为假阳性，这种错误标签会导致次优处方、增加广谱抗生素使用、提升毒性风险及加剧抗菌素耐药性，因此精准诊断至关重要。
现行的标准诊断方法，包括临床病史、皮肤试验（STs）和药物激发试验（DPT），虽然被指南推荐，但存在耗时、风险高、有时存在禁忌症等局限。作为更安全的体外替代方案，特异性IgE（sIgE）测定、嗜碱性粒细胞活化试验（BAT）和新兴的肥大细胞活化试验（MAT）正逐渐成为诊断的重要补充。sIgE测定（如ImmunoCAP）存在灵敏度有限（约39-52%）及假阳性问题，且其灵敏度会随时间下降。BAT虽被推荐，但受限于其灵敏度（约51%）、特异性（约89%），以及10-15%的患者存在嗜碱性粒细胞无反应（非释放者）的情况，使其无法作为独立诊断工具。
方法
本研究旨在评估一种基于人CD34+外周血细胞分化的肥大细胞（dMCs）的MAT，用于诊断AX过敏。研究采用回顾性观察设计，纳入28例确诊为AX速发型过敏的患者和11例对AX耐受的对照者。研究核心在于将新型工程化抗原与传统刺激物结合使用。
肥大细胞来源于商业CD34+外周血细胞，经过10-12周的培养分化为高纯度（≥90% CD117+/FcεRI+）的dMCs。试验中，dMCs首先用患者或对照者的血清（含或不含AX特异性IgE）进行被动致敏，致敏过程在含有胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）的培养基中进行。随后，细胞用白细胞介素-33（IL-33）进行短期预处理，以增强其反应性。激活刺激物包括：
- 1.
游离阿莫西林（AX）：测试了三种浓度。
- 2.
树枝状阿莫西林酰结合物（G4/G5-AXO）：使用第4代（G4）和第5代（G5）聚酰胺-胺（PAMAM）树枝状聚合物与AXO共价连接而成，每个分子分别携带64和128个AXO单位。
- 3.
人血清白蛋白-阿莫西林酰结合物（HSA-AXO）：作为传统载体的对照。
细胞激活通过流式细胞术检测表面CD63的表达来量化。诊断性能的临界值通过受试者工作特征（ROC）曲线分析确定，并与BAT（使用游离AX）和ImmunoCAP测定血清AX-sIgE（c6）的结果进行比较。
结果
- 1.
MAT能够有效区分AX过敏患者与对照者
无论是游离AX还是G4/G5-AXO树枝状结合物，均能诱导过敏患者组dMCs的CD63表达显著高于对照组。所有刺激物在所有测试浓度下均保持了100%的特异性。在最优浓度下，游离AX（3420 μM）的灵敏度达到53.57%，而G4-AXO和G5-AXO（10 μM AX当量浓度）的灵敏度均为46.43%。
- 2.
结合多种抗原刺激可显著提升MAT诊断灵敏度
研究发现，患者对游离AX和树枝状结合物的反应模式存在部分重叠，但也有患者仅对其中一种刺激物产生阳性反应。这种互补性使得当将游离AX与G4/G5-AXO的结果进行组合判读时，MAT的整体诊断灵敏度提升至75%，同时仍然保持100%的特异性。在游离AX检测为假阴性的患者中，有42.86%可通过树枝状结合物被识别为阳性。
- 3.
抗原刺激反应模式与患者的临床过敏分型相关
分析显示，仅对AX过敏（AX选择性）的患者更倾向于对游离AX产生阳性反应（66.67%），而对青霉素交叉过敏的患者则对G4/G5-AXO树枝状结合物的反应率更高（G4-AXO: 85.71%）。这一发现提示，不同临床分型的患者可能具有不同的IgE识别表位谱。
- 4.
MAT性能与现有体外诊断方法的比较
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与sIgE（ImmunoCAP）比较：单独使用游离AX的MAT灵敏度略高于ImmunoCAP的46.43%。组合MAT的灵敏度（75%）显著优于ImmunoCAP。此外，MAT的特异性为100%，而ImmunoCAP出现一例假阳性（特异性90.9%）。有趣的是，MAT对G4/G5-AXO的反应强度与ImmunoCAP测得的AX-sIgE水平呈中度至强相关，而与游离AX的反应无此相关性，这可能反映了不同抗原形式的相似性。
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与BAT比较：在可评估的23例患者中，BAT使用游离AX的灵敏度为60.87%。MAT单独使用游离AX或树枝状结合物的灵敏度略低，但组合MAT的灵敏度达到73.91%，与BAT相当。更重要的是，MAT在BAT无法评估或结果为非释放者的患者中成功检测出了阳性病例，显示其在此类困难情况下的应用潜力。
讨论与结论
本研究表明，在优化条件下（使用dMCs、细胞因子预激、引入工程化抗原），MAT可作为诊断AX速发型过敏反应的有效体外工具。其核心优势在于通过结合游离药物和稳定的多价树枝状药物结合物，能够覆盖患者群体中异质性的IgE反应谱，从而显著提高检测灵敏度（至75%），同时维持极高的特异性（100%）。
该研究揭示了AX过敏患者中可能存在两种不同的IgE反应模式：一种更倾向于识别由游离药物在体内/体外临时形成的药物-蛋白加合物（对应游离AX刺激），另一种则依赖预先形成的、稳定的多价抗原表位（对应G4/G5-AXO刺激）。这一认识有助于解释为何传统的基于单一抗原形式的体外诊断方法（如sIgE或BAT）灵敏度有限。
相较于现有方法，优化后的MAT不仅提供了可与BAT媲美甚至更优的诊断性能，还能有效弥补sIgE测定灵敏度不足和BAT存在“非释放者”局限性的问题。因此，MAT有潜力整合到β-内酰胺类抗生素过敏的诊断流程中，作为早期筛查或复杂/模糊病例的补充检测手段，以减少不必要的全面侵入性检查，促进抗生素的精准合理使用。未来需要在前瞻性临床研究中进一步验证其诊断价值。
