缺血/再灌注损伤过程中线粒体Ca2+的性别差异：S-亚硝基化作用的作用

《Journal of Molecular and Cellular Cardiology》：Sex differences in mitochondrial Ca2+ during ischemia/reperfusion injury: A role for S-Nitrosylation

心肌缺血再灌注损伤中，女性线粒体Ca2+积累显著低于男性，机制与线粒体Ca2+单向转运体（MCU）的S-硝基化调控相关。NO信号通路介导性别差异：女性MCU S-硝基化增强抑制转运，而男性受NO供体激活转运通道抑制。MCU基因敲除小鼠消除性别差异，证明MCU是关键靶点。该研究揭示性别特异性红ox调节调控线粒体Ca2+稳态的新机制。

　　

罗曼·芭芭拉（Roman Barbara）|彼得森·考特尼（Petersen Courtney）|孙俊辉（Sun Junhui）|墨菲·伊丽莎白（Murphy Elizabeth）

美国马里兰州贝塞斯达市国立卫生研究院（National Institute of Health）下属的国家心肺血液研究所（National Heart, Lung, and Blood Institute）

摘要

已有研究表明心脏缺血/再灌注（I/R）损伤存在性别差异，但这些差异背后的机制仍不明确。由于线粒体Ca²⁺的积累在I/R损伤中起重要作用，我们探讨了是否存在性别特异性差异。

为了监测Langendorf灌注心脏中的线粒体Ca²⁺水平，我们使用了一种基因编码的、靶向线粒体的Ca²⁺指示剂（R-GECO1），通过腺相关病毒载体（AAV9）进行递送。在20分钟的缺血期间，雄性心脏的线粒体Ca²⁺积累量显著高于雌性心脏。有趣的是，在缺乏线粒体Ca²⁺单向转运蛋白（MCU）的小鼠心脏中，未观察到缺血期间Ca²⁺积累的性别差异，这表明MCU在此过程中起着重要作用。由于一氧化氮（NO）及其翻译后修饰S-亚硝基化被认为可以调节Ca²⁺稳态的性别差异，我们在雌性心脏中抑制了NO信号通路，结果发现线粒体Ca²⁺积累增加；而在雄性心脏中，使用NO供体处理后线粒体Ca²⁺水平降低，表明S-亚硝基化以性别依赖的方式调节缺血期间的Ca²⁺摄取。

通过使用生物素交换测定法（biotin-switch assay）分析分离的线粒体，我们发现雌性线粒体的MCU S-亚硝基化程度高于雄性。最后，暴露于NO供体的雄性线粒体表现出较低的Ca²⁺摄取率，与未经处理的雌性线粒体相当。综上所述，这些发现表明MCU的S-亚硝基化减少了缺血期间的线粒体Ca²⁺摄取，揭示了线粒体功能的一个新的氧化还原调控层面，其中性别是一个关键因素。

引言

缺血/再灌注（I/R）会导致心肌损伤和细胞死亡，是导致心肌肥大和心力衰竭的重要原因。I/R损伤的一个核心介质是线粒体钙（Ca²⁺）过载，这会引发线粒体通透性转变孔（mPTP）的开放，从而导致线粒体功能障碍、能量代谢紊乱和细胞死亡[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]。虽然线粒体Ca²⁺的摄取对代谢调节是必要的，但过度积累会对细胞造成损害。此外，男性和女性对I/R损伤的敏感性存在差异[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。临床前研究表明，女性心脏患心血管疾病的风险较低，并且缺血后的恢复能力优于男性[14]、[15]、[16]。然而，导致这些性别特异性结果的潜在机制仍大部分未知。明确这些差异至关重要，因为揭示女性心脏的保护机制可能会为减少两性中的I/R损伤提供新的策略。

线粒体Ca²⁺的调控在细胞存活中起着关键作用，尤其是在I/R损伤等应激条件下。线粒体Ca²⁺稳态由协调的流入和流出途径维持，其中线粒体Ca²⁺单向转运蛋白（MCU）是主要的进入途径[17]、[18]。MCU在心脏I/R损伤中起着重要作用[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]，它存在于一个多蛋白复合体（MCUc）中，该复合体定位于线粒体内膜。MCUc的组分包括同源蛋白MCUb[25]、必需的MCU调节因子EMRE[26]、支架蛋白MCUR1[28]以及膜间隙调节亚基：线粒体钙摄取蛋白1、2和3（MICU1、MICU2和MICU3）[29]、[30]、[31]、[32]、[33]、[34]、[35]。MCUc的组成会随细胞类型和生理状态而变化[36]、[37]。MCUc的组成决定了细胞在生理和病理条件下对细胞质Ca²⁺波动的反应。

性激素在调节心脏中多种蛋白质的表达中起关键作用，包括一氧化氮合酶（NOS）。多项研究表明，雌激素在女性心脏中上调内皮NOS（eNOS）和神经元NOS（nNOS）的表达[38]、[39]、[40]、[41]。NOS催化一氧化氮（NO）的生成，NO是一种参与氧化还原调节和细胞功能的信号分子[42]、[43]、[44]、[45]。NO通过一种可逆的翻译后修饰——S-亚硝基化来修饰蛋白质，在这种修饰中，一个亚硝基被添加到活性半胱氨酸残基上[46]。这种修饰可以改变蛋白质的活性，在某些情况下还可以保护关键巯基免受不可逆的氧化损伤[46]、[47]、[48]、[49]、[50]。因此，NO在I/R损伤等应激条件下有助于心脏保护[45]、[51]、[52]、[53]。一项蛋白质组学研究显示，女性心脏中的S-亚硝基化蛋白质水平显著高于男性[53]。这些发现表明，S-亚硝基化可能是女性心脏具有更强保护作用的原因。在本研究中，我们探讨了NO信号通路是否参与了I/R期间线粒体Ca²⁺积累的性别差异。为了验证这一假设，我们使用跨壁光谱技术测量了雄性和雌性小鼠离体灌注心脏中的线粒体Ca²⁺水平。我们使用一种基因编码的、靶向线粒体的红色荧光Ca²⁺指示剂（R-GECO1）监测线粒体基质中的Ca²⁺水平。我们观察到，在缺血期间，雌性心脏的线粒体Ca²⁺积累增幅显著低于雄性心脏，并进一步发现NO抑制剂可以阻断雌性心脏中线粒体Ca²⁺的增幅降低，而NO供体处理则降低了雄性心脏的线粒体Ca²⁺增幅。在分离的雌性线粒体中，我们发现MCU的S-亚硝基化程度更高。此外，向分离的雄性线粒体中添加NO供体后，Ca²⁺摄取率增加，而用NO供体处理雌性线粒体则没有这种效果。综上所述，我们的结果表明雌性线粒体中MCU的S-亚硝基化程度更高，这减弱了通道活性，从而导致线粒体Ca²⁺积累减少，这是I/R损伤的特征。

实验部分

实验动物

本实验使用了野生型（WT）小鼠和MCU敲除小鼠（MCU-KO，基因组删除），背景为CD1[24]。这些可繁殖的成年雄性和雌性小鼠年龄为8-12周，生活在12小时光照-黑暗周期的环境中，食物和水可自由获取。所有实验中的小鼠均随机分组。实验过程中未发现心脏重量与体重比存在性别差异。

所有动物实验均按照相关规范进行

缺血期间线粒体Ca²⁺的性别依赖性差异

为了研究I/R期间线粒体Ca²⁺的作用，我们采用了积分球（integrating sphere）中的光学跨壁光谱技术，该技术能够实时测量灌注和跳动心脏中的游离线粒体Ca²⁺水平。我们使用基因编码的、靶向线粒体的Ca²⁺指示剂R-GECO1来监测线粒体中的Ca²⁺，该指示剂含有双重COX8线粒体靶向序列，此前已被证明能够定位于线粒体[54]。

雄性和雌性野生型（WT）小鼠的心脏

讨论

本研究表明，缺血期间线粒体Ca²⁺的积累存在性别差异，雌性心脏的线粒体Ca²⁺增幅显著低于雄性心脏。有趣的是，在MCU-KO小鼠中，这种性别差异消失了，这表明MCU在调节线粒体Ca²⁺处理中起作用。为了阐明这一性别差异的机制，我们探讨了S-亚硝基化的作用

研究的局限性

我们的光学采集协议并未针对快速Ca²⁺变化进行优化，因此无法捕捉到再灌注期间线粒体Ca²⁺的快速变化。因此，其他人报告的短暂再灌注后Ca²⁺峰值[83]、[84]可能无法通过我们的方法检测到。

此外，我们的光谱装置（积分球）中，光学纤维位于左心室，无法同时插入气球来测量机械功能。

致谢/资金支持

本研究由NHLBI内部项目（ZIA-HL-002066）资助。

作者贡献声明

罗曼·芭芭拉（Roman Barbara）：撰写初稿、项目管理、方法设计、实验实施、数据分析、概念构建。彼得森·考特尼（Petersen Courtney）：撰写与编辑、数据可视化、数据分析。孙俊辉（Sun Junhui）：撰写与编辑、数据验证、实验监督。墨菲·伊丽莎白（Murphy Elizabeth）：撰写与编辑、数据验证、实验监督、资金筹集、概念构建。

写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

作者在撰写本手稿时未使用生成式AI或AI辅助技术。

利益冲突声明

作者在本手稿的撰写过程中未涉及任何利益冲突。