Salvia plebeia R. Br. 的提取物通过 Atg7 依赖的自噬作用延缓细胞衰老并促进健康老龄化，其中迷迭香酸是其主要的生物活性成分

《The Journal of Nutritional Biochemistry》：Salvia plebeia R. Br. extract delays cellular senescence and promotes healthy aging via Atg7-dependent autophagy, with rosmarinic acid as a major bioactive constituent

本研究探讨紫地丁乙醇提取物（SPE）通过激活自噬通路抑制D-半乳糖诱导的细胞衰老，并验证其抗衰老活性。体内实验显示SPE改善衰老小鼠生理功能及认知能力，减少tau蛋白沉积，其核心活性成分Rosmarinic Acid（RA）通过Atg7依赖性机制发挥作用。SPE具有良好安全性和潜在应用价值。

　　

何艳妮|李世英|徐佩|周星月|曾静|秦大莲|熊庚|于璐|任伟|吴安国|吴建明|周小刚

四川新药发现与药物评价重点实验室，中国西南地区中药活性筛选与药物评价重点实验室，西南医科大学药学院，四川泸州646000；中国西南地区作物基因探索与利用国家重点实验室，四川农业大学，成都611130

摘要

衰老的特征是细胞功能逐渐衰退以及对慢性疾病的易感性增加。增强自噬（一种关键的细胞清除机制）为对抗衰老提供了一种有前景的策略。在本研究中，我们利用体外和体内模型探讨了Salvia plebeia R. Br. 乙醇提取物（SPE）的自噬诱导和抗衰老特性。结果表明，SPE能够促进自噬体及自噬溶酶体的形成，提高LC3-II和Beclin-1的水平，并降低人类包皮成纤维细胞（HFFs）中的p62表达，从而证实了其自噬诱导作用。SPE还能减轻D-半乳糖（D-gal）诱导的细胞衰老，降低SA-β-半乳糖染色、衰老标志物（p16、p21）、SASP因子和γ-H2AX焦点。这些效应依赖于Atg7，因为Atg7敲除会消除这些效果，突显了自噬在SPE作用中的重要性。在体内实验中，SPE改善了小鼠的身体功能，逆转了细胞衰老，增强了抗氧化防御，并恢复了D-半乳糖诱导的早衰小鼠的自噬活性。此外，SPE还缓解了与年龄相关的认知衰退，减少了神经元损伤，增加了突触密度，并减轻了Tau蛋白的积累。值得注意的是，SPE在12周内具有良好的耐受性，体重稳定，没有明显的组织损伤，血清ALT、AST和肌酐水平也未发生变化。化学分析显示迷迭香酸（RA）是主要的生物活性成分，在体外再现了与自噬和衰老相关的关键效应。这些发现表明，SPE是一种有前景的天然自噬增强剂，具有促进健康衰老、对抗与年龄相关疾病以及作为治疗衰老相关细胞功能障碍的新策略的潜力。

引言

衰老是一个复杂的生物学过程，随着时间的推移逐渐发生，导致细胞结构和功能完整性逐渐恶化[1]。这种逐渐的衰退不仅降低了生活质量，还增加了个体随年龄增长而死亡的风险。研究表明，1990年至2017年间，全球死亡率上升的主要驱动因素是人口老龄化。缺血性心脏病和中风在老年人中较为普遍，是这一趋势的重要原因[2]。这突显了老年人口增长与年龄相关疾病增加之间的联系，从而导致更高的死亡率。衰老也是多种疾病（尤其是神经退行性疾病，如阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD））发展的关键因素[3]。目前，65岁及以上的全球人口正在以前所未有的速度增长，预计到2050年将达到16亿[4]。这一人口结构变化伴随着慢性疾病的增加，增加了老年人身体和认知功能障碍的风险。因此，开发促进健康衰老并减缓与年龄相关疾病进展的策略至关重要。

自噬-溶酶体途径是一种关键的、保守的细胞降解过程，负责清除受损的细胞器和病理蛋白。它在正常生理条件下维持细胞稳态，并确保必需分子（如氨基酸）的稳定供应[5]。然而，越来越多的证据表明，各种生物体的自噬活性会随年龄增长而下降，自噬功能障碍现已被认为是衰老的十二个标志之一[6]。在秀丽隐杆线虫（C. elegans）、啮齿动物和人类细胞中的研究表明，衰老与关键自噬相关基因（如ATG5、ATG7和BECN1）的表达减少有关，而这些基因对自噬的启动和功能至关重要[7]。因此，增强自噬活性成为延缓衰老和减轻与年龄相关状况的有前景的策略。许多研究强调了增强自噬的化合物的抗衰老效果。例如，雷帕霉素通过抑制mTOR活性来激活自噬，已被证明可以延长小鼠的寿命并改善健康寿命[8]。同样，二甲双胍通过AMPK/mTOR途径增强自噬，促进与年龄相关蛋白质的降解并减轻细胞衰老[9,10]。因此，自噬增强剂成为衰老干预的有希望的候选物质，促使人们努力寻找安全有效的药物。

天然医学，特别是传统中医（TCM），因其整体性和长期应用而受到关注，被认为有助于促进健康衰老。在本研究中，我们使用GFP-RFP-LC3 U87细胞系作为工具来监测自噬流，从而快速筛选包括粗提物、组分和单体化合物在内的多种自然资源，以评估其增强自噬的能力。这种筛选发现Salvia plebeia R. Br.（SP，“李枝草”）是一种新的自噬诱导剂。SP在中国、伊朗、日本、韩国、印度和澳大利亚广泛分布[11]，传统上用于治疗肾炎、支气管炎、感冒、流感和类风湿性关节炎等炎症性疾病。除了药用价值外，SP还具有抗氧化、抗菌和抗病毒特性[12]，也被用作营养补充剂或草药茶，体现了其饮食相关性。先前的研究表明，SP的乙醇提取物（SPE）可以防止UVB诱导的光老化，其中同植物素（Hom）被确定为能够缓解血管衰老的活性成分[[13], [14], [15]]。在本研究中，我们使用多种衰老模型进一步探讨了SPE的分子机制和抗衰老效果。我们发现SPE在原代人类包皮成纤维细胞（HFFs）中诱导自噬，并通过Atg7依赖的自噬激活来减轻细胞衰老。在D-半乳糖（D-gal）诱导的早衰小鼠模型中，SPE补充剂改善了生理和认知功能，促进了体内健康衰老。最后，我们确定迷迭香酸（RA）是负责自噬诱导和延缓衰老的主要生物活性化合物。RA是一种多酚类咖啡酸酯，在唇形科植物（如Perilla frutescens、Rosmarinus officinalis和Melissa officinalis）中含量丰富，这些植物广泛用作食物、茶叶和草药，体现了其双重营养和药用价值[16]。总体而言，我们的研究表明SP和RA是具有营养相关性的抗衰老剂，能够增强自噬并缓解与年龄相关的功能障碍，为进一步的机制研究和转化开发奠定了基础。

实验部分

SPE的提取

SPE从河北永义中药有限公司购买。使用75%乙醇作为溶剂，分三个周期进行提取。每个周期在65°C下进行2小时，每次使用500毫升溶剂。三种提取物合并后过滤去除不溶性残留物，并在减压条件下浓缩。浓缩物经冻干后得到干粉（SPE）。提取产率为18.5%，药物与提取物的比例为5.4:1（w/w）。

使用GFP-RFP-LC3 U87细胞鉴定SPE作为自噬诱导剂

为了鉴定潜在的自噬诱导剂，我们使用GFP-RFP-LC3 U87细胞（一种广泛用于监测自噬的模型）筛选了我们的天然产物库。在测试的化合物中，如图1A所示，SPE显著增加了GFP-LC3点的积累，表明其具有自噬诱导作用。接下来，我们检查了SPE是否以浓度和时间依赖的方式诱导自噬。首先，使用CCK-8试剂在24小时、48小时和72小时不同浓度下评估了细胞毒性

讨论

自噬是一种核心的质量控制途径，维持蛋白质稳态和细胞器完整性，其与年龄相关的下降与多种慢性疾病（包括神经退行性疾病、心血管疾病和代谢疾病）有关[[36], [37], [38]]。尽管药物诱导的自噬（例如通过mTOR抑制）可以在动物模型中改善与健康寿命相关的结果，但长期的安全性和耐受性仍然是一个重要的考虑因素[39,40]。在这个背景下，

数据可用性

所有用于支持本研究结果的图表均包含在文章中。

作者贡献

周小刚和吴安国负责监督和设计实验；何艳妮、李世英、周星月和徐佩进行了实验；曾静和于璐收集和处理数据；任伟、熊庚、秦大莲和吴建明参与了论文的讨论；何艳妮和周小刚撰写了论文。所有数据均为内部生成，未使用任何第三方数据服务。所有作者对工作的所有方面负责，确保数据的完整性和准确性。

作者贡献声明

何艳妮：撰写——初稿、方法学、研究、数据分析。李世英：方法学、研究、数据分析。徐佩：资源、方法学。周星月：方法学、研究。曾静：方法学。秦大莲：资金获取。熊庚：资源。于璐：方法学。任伟：资源。吴安国：撰写——初稿、软件、资源。吴建明：监督、项目管理、资金获取。周小刚：

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（项目编号81801398）、中国西南地区作物基因探索与利用国家重点实验室开放项目计划（项目编号SKL-KF202311）、四川省科技厅重点研发项目（项目编号2019YFS0531）以及国家中医药管理局创新团队和人才培养计划（项目编号ZYYCXTD-C-202207）的支持。