《British Journal of Haematology》：Circulating angiogenesis-related biomarkers in sickle cell retinopathy and maculopathy
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这项原创性研究通过光学相干断层扫描血管成像等技术，探索了镰状细胞病（SCD）不同基因型（HbSS和HbSC）患者外周血中多种血管生成相关因子（如血管内皮生长因子[VEGF]、血管生成素-2[Ang-2]、内皮抑素等）与增生性视网膜病变（PSCR）及黄斑病变（SCM）的关联。研究发现，在HbSC患者中，PSCR与内皮抑素水平升高有关，而Ang-2在HbSS患者中普遍升高，提示其可能与全身性缺氧相关。研究为理解SCD相关眼病的分子机制提供了新的线索。
简介
镰状细胞病（SCD）是一种遗传性血红蛋白病，其特点是反复发生微血管阻塞和慢性溶血，导致缺血和器官损伤。视网膜因其高代谢需求和终末微血管床而特别容易发生缺血，常导致镰状细胞视网膜病变（SCR）和镰状细胞黄斑病变（SCM）。SCR分为非增生性（NPSCR）和增生性（PSCR）。PSCR以周边缺血和新生血管形成为特征，可能导致玻璃体出血和视网膜脱离，影响视力。值得注意的是，PSCR在HbSC基因型患者中更常见，尽管他们的全身病程通常较轻。SCM可出现在HbSS和HbSC患者中，涉及神经退行性和血管性黄斑改变。光学相干断层扫描血管成像（OCTA）揭示了SCD患者的黄斑微血管改变，这些改变与功能缺陷相关，如对比敏感度或色觉受损，但视力常不受影响。
HbSS和HbSC基因型中SCM和PSCR的患病率差异，提示了不同的潜在机制。SCR的病理生理过程始于微血管阻塞导致的缺血阶段，随后在增生性阶段可能触发涉及血管内皮生长因子（VEGF）-A和炎症介质的继发性反应，诱导新生血管。然而，SCR与增生性糖尿病视网膜病变（PDR）等病存在不同：在PSCR中，受累视网膜区域的所有血管（毛细血管、静脉和动脉）都可能闭塞，这可以解释其短暂的新生血管反应以及随后常见的自发性纤维血管退化和瘢痕形成。之前的研究已在SCD患者的视网膜组织中观察到VEGF、色素上皮衍生因子（PEDF）、血管生成素样蛋白4（ANGPTL4）等多种因子活性增加。其中，VEGF仅在PSCR眼的房水中升高，而ANGPTL4在SCD患者的房水和玻璃体中都升高。对SCD患者静脉血中血管生成因子的研究则关注了血管生成素-1（Ang-1）、Ang-2、VEGF、PEDF等多种蛋白，发现这些因子在SCD患者中水平升高。
深入了解驱动SCR和SCM中血管闭塞和血管生成的机制，可能揭示新的治疗靶点并有助于识别特定风险因素。本研究旨在探索外周静脉血中与血管生成和血管系统相关的因子，作为SCR和SCM的潜在生物标志物，并研究它们与临床和实验室特征之间的关联。
方法
本研究是一项单中心病例对照研究，由荷兰阿姆斯特丹UMC的眼科和血液科共同进行。研究获得了阿姆斯特丹UMC机构审查委员会和伦理委员会的批准（ClinicalTrials.gov-ID: NCT06396403），并根据《赫尔辛基宣言》的原则进行。所有参与者在筛选前均签署了书面知情同意书。
成人HbSS或HbSC基因型患者被邀请参与研究。眼科检查包括Snellen最佳矫正远视力、裂隙灯检查和扩瞳眼底镜检查。SCR分期根据改良的Goldberg分类法确定。通过光学相干断层扫描（OCT）和OCTA扫描评估黄斑病变，具体评估参数包括：OCTA上的中心凹无血管区（FAZ）不规则性（例如，血管扩大或病理性血管缺失区域）以及OCT上的黄斑变薄（定义为至少一个标准ETDRS黄斑亚区中，视网膜厚度彩色编码图上出现蓝色区域）。为减少血小板激活对血管生成因子测量的影响，采取了专门的采血步骤，包括使用开放式采血系统、采血前禁食或低脂早餐、以及避免在采血前吸烟、运动和饮用咖啡。
在初步分析中，使用RayBio Human Angiogenesis Array C-series 1000阵列试剂盒对四个患者组的样本池进行了筛选（每组由四名个体的混合样本代表）。该初步分析揭示了几个有希望的蛋白，包括内皮抑素、内皮糖蛋白（CD105）、白细胞介素-6（IL-6）和IL-10。随后，使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒定量测量了血浆中VEGF、Ang-2、粒细胞集落刺激因子（GCSF）、内皮抑素、内皮糖蛋白、IL-6和IL-10的浓度。此外，还测量了血小板因子4（PF4）和β-血小板球蛋白（β-TG）以评估采血过程中血小板激活的情况。统计方法包括卡方检验、t检验、Kruskal-Wallis检验、Dunn多重比较检验和Spearman等级相关分析。
结果
研究共纳入了66名患者（HbSS和HbSC各33名），其中男性31名（47%），女性35名（53%），平均年龄为33.2岁。PSCR存在于26名患者（39.4%）中，且主要见于HbSC基因型（p < 0.001）。高质量的OCTA和SD-OCT扫描分别对61名（92.4%）和62名（93.9%）患者可用。50.8%（31/61）的患者存在FAZ异常，48.4%（30/62）的患者存在黄斑变薄。羟基脲由27名患者（40.9%）使用，主要为HbSS基因型患者（p < 0.001）。
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视网膜病变
在HbSC患者中，与无PSCR的患者相比，PSCR患者的血浆内皮抑素浓度显著更高（p = 0.030）。在两种基因型中，对于其他检测的蛋白质（Ang-2、内皮糖蛋白、GCSF、IL-6、IL-10和VEGF），在有无PSCR的患者之间均未发现显著差异。此外，Ang-2的浓度在HbSS基因型患者中显著高于HbSC基因型患者（p < 0.0001），但未因PSCR状态而有所不同。羟基脲治疗与内皮抑素水平无独立关联。
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黄斑病变
血浆蛋白浓度（包括Ang-2）与是否存在FAZ异常或黄斑变薄均无显著相关性。与视网膜病变的结果一致，Ang-2水平在HbSS患者中更高，但并未在有无黄斑病变的患者中显示出区别。
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蛋白质与实验室特征的相互作用
相关分析显示，Ang-2与IL-10、IL-6和VEGF呈显著相关。IL-10与IL-6之间存在强相关性。在标准的实验室特征中，只有网织红细胞计数与Ang-2水平相关，乳酸脱氢酶（LDH）与IL-10水平相关。
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血小板激活的差异
本研究测量到的PF4和β-TG水平显著高于正常参考范围。然而，在不同视网膜病变状态或基因型的患者组之间，PF4或β-TG的血浆水平没有显著差异。VEGF与PF4之间存在微弱但显著的相关性（R = 0.268, p = 0.034）。PF4和β-TG在个体样本中未发现相关性。这些结果表明，血小板激活并未导致所研究蛋白水平在不同组别间出现差异。
讨论
在SCD中，血液粘度增加和内皮激活被认为会驱动视网膜微血管闭塞，引起周边无灌注和缺血，进而可能促进血管生成活性。本研究发现，在外周血众多血管生成相关生物标志物中，仅在HbSC合并PSCR的患者中观察到内皮抑素水平升高；而Ang-2在HbSS患者中普遍升高，但与SCR分期或SCM的存在无关。这些发现为理解SCD相关眼病的机制提供了新的视角。
Ang-2是SCR中研究最多的血管生成因子之一。本研究未发现Ang-2水平与SCR或SCM的关联，这与之前一项关于成人SCD患者的研究结果一致。Ang-2在HbSS患者中升高，可能与此基因型患者更严重的全身性缺氧和缺血有关，因为Ang-2已知可由缺氧诱导。研究发现Ang-2水平与视网膜结局无关，这表明其血浆水平升高可能主要反映了全身性状况，而非眼部的局部产生。
内皮抑素是一种天然的血管生成抑制剂，在SCD中的作用尚不清楚。与先前一项研究结果不同，本研究发现HbSC合并PSCR的患者内皮抑素水平更高。在增生性视网膜病变中，通常认为缺血会引发促血管生成状态。然而，PSCR患者中观察到的内皮抑素升高，可能反映了眼部存在一种被激活的代偿机制，旨在调节和控制异常的新生血管形成，这可能解释了PSCR新生血管常会自发消退的现象。
VEGF是血管生成驱动的疾病（如PDR）中的关键因子，在缺血视网膜中局部产生。本研究未发现循环VEGF浓度在各组间存在显著差异。准确测量VEGF高度依赖于血小板激活的影响。本研究中PF4和β-TG水平显著升高，反映了采血过程中血小板激活的存在。然而，这些血小板标记物的水平在不同组间没有差异，表明血小板激活不能解释本研究观察到的组间差异。尸检研究表明，视网膜组织中VEGF免疫反应性在灌注的视网膜和新生血管病变中增加，这表明VEGF可能在PSCR的发病机制中发挥局部作用，类似于其在PDR中的作用。
本研究存在一些局限性。HbSS合并PSCR的患者数量较少，可能影响了该组数据分析的稳健性。此外，未常规进行荧光素血管造影检查，可能低估了Goldberg I/II期视网膜病变的患病率。VEGF测量受血小板激活影响，尽管本研究通过检测PF4和β-TG对此进行了评估，但绝对水平仍然偏高。
结论
总之，在一系列循环生物标志物中，仅发现内皮抑素水平在HbSC合并PSCR的患者中高于无PSCR者。Ang-2水平在HbSS患者中高于HbSC患者，但不随SCR分期或SCM的存在而变化。这些结果为了解这些因子在SCR和SCM中的潜在作用提供了有价值的见解，但需要进一步的研究来阐明其确切贡献。
作者贡献、致谢与资助
本研究由B.J.B.和R.M.H.D.构思，并与I.K.和R.O.S.合作设计。样本和数据收集由R.P.B.和I.K.完成。初步分析由R.P.B.、I.K.和R.d.C.执行，并由E.N.、R.O.S.、B.J.B.和R.M.H.D.审阅。稿件由R.P.B.起草，并由I.K.、R.d.C.、E.N.、R.O.S.、B.J.B.和R.M.H.D.修订。所有作者均批准了最终版本。
本研究感谢Stichting Pupil等多个基金会的支持。资助方在研究的设计或实施中未发挥作用。
利益冲突声明
多位作者披露了来自不同制药公司、基金会的科研资助或咨询、讲座酬劳。R.M.H.D.、R.d.C.和I.K.声明无利益冲突。
