《British Journal of Pharmacology》：Induction of IL-9-producing CD8+ T cells by ascochlorin derivatives
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本研究揭示，新型Ascochlorin（ASC）衍生物N184能在体外以低毒性方式诱导T细胞抗原受体（TCR）刺激后的CD8+T细胞产生IL-9，形成具有Tc9样特征的细胞亚群。N184处理显著延长了CD8+T细胞存活期，上调抗凋亡蛋白（Bcl-xL， Mcl-1），提升增殖后期细胞因子（IFNγ， TNFα）产量，并抑制细胞耗竭标志物（PD-1， TIM3）表达。小鼠体内实验证实，口服N184能以剂量依赖的方式抑制多种实体瘤（MO5黑色素瘤、MethA肉瘤、CT26结肠癌）生长，该效应完全依赖于CD8+T细胞与IFNγ信号，并部分依赖于IL-9。该研究为ASC衍生物开辟了通过调控T细胞免疫功能实现抗肿瘤的新途径，为肿瘤免疫治疗提供了潜在新策略。
研究背景与目的
Ascochlorin（ASC）是一种从真菌Ascochyta viciae（现鉴定为Acremonium sclerotigenum）发酵液中发现的抗生素，已知对多种癌细胞具有直接抑制作用，但其对免疫细胞（特别是T细胞）的影响尚不明确。本研究旨在评估一系列新合成的ASC衍生物对T细胞的影响，以探索其通过免疫介导机制发挥抗肿瘤作用的潜力。
主要研究方法
研究团队合成了一系列ASC衍生物，并利用小鼠脾脏分离的CD4+和CD8+T细胞，通过T细胞抗原受体（TCR）刺激（抗CD3ε和抗CD28单克隆抗体）进行体外增殖实验，筛选出毒性较低的化合物。通过细胞计数试剂盒（CCK-8）检测细胞毒性，台盼蓝染色评估细胞活力，蛋白质印迹法分析抗凋亡蛋白表达，流式细胞术检测细胞因子产生（如IFNγ、TNFα、IL-2、IL-9）及耗竭标志物（PD-1、TIM3），并通过定量逆转录聚合酶链反应（qPCR）分析相关基因表达。在体内实验中，给小鼠皮内接种多种肿瘤细胞系（如MO5黑色素瘤、MethA肉瘤、CT26结肠癌），然后口服给予候选化合物N184，评估其抗肿瘤效果。同时，通过注射抗CD8单克隆抗体耗竭CD8+T细胞，或注射抗IL-9中和抗体，来验证其抗肿瘤作用的免疫依赖性。
关键发现与结果
1. N184的低毒性及对CD8+T细胞存活率的增强作用
在筛选的ASC衍生物中，N184和N201对MO5黑色素瘤细胞及小鼠T细胞的毒性比ASC低10倍以上。特别是，10 μM的N184不仅无细胞毒性，反而能显著增强TCR刺激后CD8+T细胞的存活率，培养至第6天时，细胞存活率比对照组提高约5倍。该效应与上调抗凋亡蛋白Bcl-xL、Mcl-1和磷酸化Bad（p-Bad）的表达相关。相比之下，N184对CD4+T细胞存活率的增强作用较弱。
2. N184在体内依赖CD8+T细胞发挥抗肿瘤作用
口服N184能剂量依赖性地抑制MO5黑色素瘤在小鼠体内的生长，100 mg kg-1的剂量效果最显著，且治疗起始时间越早（如肿瘤接种后第7天开始），效果越好。该抗肿瘤作用在免疫缺陷的SCID小鼠中完全消失，通过抗体耗竭CD8+T细胞也能完全阻断此效应，证明其完全依赖于CD8+T细胞。此外，N184对MethA肉瘤和CT26结肠癌的生长也有抑制作用。对肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的分析显示，N184处理组小鼠的CD8+TILs具有更强的多细胞因子（IL-2、IFNγ、TNFα）共生产能力，且Bcl2表达水平更高。
3. N184通过诱导IL-2和IL-9产生延长CD8+T细胞存活
培养上清交换实验表明，N184处理组CD8+T细胞分泌的可溶性因子（如细胞因子）以自分泌方式介导了其存活延长效应。qPCR分析显示，N184处理能上调CD8+T细胞中IL-2和IL-9的mRNA表达。使用中和抗体实验证实，同时阻断IL-2和IL-9能完全取消N184对CD8+T细胞存活的增强作用，而单独阻断IL-15无效。这表明IL-2和IL-9在N184介导的细胞存活中起关键作用。
4. N184诱导CD8+T细胞产生类似Tc9亚群的细胞因子谱
流式细胞术分析显示，N184处理的CD8+T细胞在培养早期（第3-4天）IFNγ产生受到抑制，但在后期（第7天）恢复并超过对照组。同时，TNFα和IL-2的产生在后期持续升高。更重要的是，N184处理诱导了低水平的IL-9蛋白产生。由于IFNγ已知会抑制IL-9产生，在培养中加入抗IFNγ中和抗体后，IL-9的产生进一步增加。这种细胞因子表达模式（早期IFNγ抑制，后期恢复，并伴有IL-9产生）与在IL-4和TGF-β诱导下分化的Tc9细胞亚群的特征相似。
5. N184减少CD8+T细胞耗竭，且早期处理效应持久
与对照组相比，N184处理显著降低了CD8+T细胞表面耗竭标志物PD-1和TIM3的双阳性表达。将经过7天N184处理的CD8+T细胞移除N184后进行再刺激培养，其高存活率、强细胞因子产生能力和低耗竭状态得以维持至第28天。这表明N184在TCR刺激初期的处理，能够对CD8+T细胞产生持久的功能性“编程”效应。
6. N184处理时机对CD8+T细胞功能的影响
时序添加实验表明，N184需要在TCR刺激后的最初24小时内添加，才能最大程度地延长细胞存活和抑制耗竭标志物表达。而其对细胞因子（IFNγ、IL-2、TNFα）产生的增强作用，则在更晚的时间点（如刺激后72小时内）添加N184也能实现。IL-9的产生则严格依赖于N184在TCR刺激初期的存在。
7. N184的抗肿瘤作用完全依赖IFNγ，部分依赖IL-9
利用对IFNγ信号无响应的B16 fucci-δIC肿瘤细胞进行实验发现，N184无法抑制其生长，表明肿瘤细胞上的IFNγ受体（IFNGR）信号传导对于N184的抗肿瘤效应是绝对必需的。此外，在MO5荷瘤小鼠体内注射抗IL-9中和抗体，能部分（而非完全）削弱N184的抗肿瘤效果。然而，同样的IL-9中和处理并不影响另一种免疫调节剂二甲双胍（metformin）的抗肿瘤作用，提示IL-9的作用对N184具有特异性。
讨论与结论
本研究首次发现ASC衍生物N184和N201能通过免疫调节途径发挥抗肿瘤作用。它们能选择性地增强CD8+T细胞的存活，诱导其产生少量IL-9，并分化出具有Tc9样特征但又不完全相同的细胞亚群。这些细胞表现出增强的多功能细胞因子产生能力、减少的耗竭状态和持久的生存优势。
N184介导的抗肿瘤作用机制是双重的：其一，完全依赖于CD8+T细胞产生的IFNγ对肿瘤细胞的直接作用；其二，部分依赖于IL-9对CD8+T细胞存活的维持作用。与传统的Tc9细胞相比，N184诱导的CD8+T细胞在细胞因子谱（更高IL-2）和耗竭程度上存在差异，可能代表一个新的功能亚群。
该研究的发现具有重要意义，它揭示了ASC衍生物作为免疫调节剂的新功能，为肿瘤免疫治疗（如过继性T细胞疗法、CAR-T细胞疗法）中改善T细胞持久性和功能提供了新的化合物工具和思路。未来需要进一步研究N184对人类CD8+T细胞的影响，及其在肿瘤转移抑制和其他肿瘤微环境组分中的作用。
