《Cancer Reports》：DNA Hypermethylation of the ZNF382 Promoter Region and Low mRNA Expression of ZNF382 Promote Diffuse Large B-Cell Lymphoma Occurrence and Progression
编辑推荐：
本文通过甲基化特异性PCR和反转录聚合酶链反应等技术，深入探讨了Zinc finger protein 382 (ZNF382)启动子区DNA高甲基化与mRNA低表达在弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)发生发展中的作用。研究发现，通过去甲基化药物地西他滨（DAC）干预可降低启动子甲基化水平并上调ZNF382表达，同时诱导细胞凋亡；而过表达ZNF382则能显著抑制DLBCL细胞的增殖、迁移和克隆形成能力。这提示ZNF382在DLBCL中可能扮演重要的抑癌基因角色，为DLBCL的诊断和治疗提供了新的潜在靶点。
弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是一种高度恶性的非霍奇金淋巴瘤（NHL），发病率高，约占NHL病例的三分之一。尽管R-CHOP一线化疗方案有效，但仍有高达50%的复发或难治性DLBCL患者预后极差。因此，深入研究DLBCL的发病机制具有重要的临床意义。本研究聚焦于锌指蛋白382（ZNF382），探讨其启动子区DNA甲基化状态和mRNA表达水平与DLBCL发生发展的关联及其临床价值。
1. 引言
锌指蛋白家族是哺乳动物中最大的转录因子家族，ZNF382是其中一个亚型，位于19q13.12位点，在细胞生长中起着关键作用。已有研究表明ZNF382在多种肿瘤中发挥抗肿瘤效应。本研究团队先前的研究证实，DLBCL患者淋巴结组织中ZNF382表达显著下调，且与疾病预后不良相关。然而，ZNF382与DLBCL之间的具体关联尚不明确。本研究旨在探究ZNF382启动子区甲基化状态、ZNF382的mRNA表达水平以及去甲基化药物干预对DLBCL细胞凋亡、增殖、迁移和克隆形成能力的影响，为理解DLBCL的发病机制以及寻找新的诊疗策略提供理论依据。
2. 材料与方法
研究使用了DLBCL细胞系（OCI-LY10和U2932）和反应性增生淋巴结组织作为实验对象。通过甲基化特异性PCR（MSP）和反转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析ZNF382启动子区甲基化水平及其mRNA表达。使用去甲基化药物地西他滨（DAC）处理细胞，观察其对甲基化状态和ZNF382表达的影响。通过流式细胞术检测细胞凋亡率。构建ZNF382稳定过表达细胞模型，利用CCK-8、Transwell和软琼脂克隆形成实验分别检测细胞的增殖、迁移和克隆形成能力。数据以均值±标准差表示，采用t检验或单因素方差分析（ANOVA）进行统计学分析。
3. 结果
3.1 ZNF382启动子甲基化在DLBCL细胞中显著增加
MSP实验结果显示，与反应性增生淋巴结组织相比，DLBCL细胞系中ZNF382启动子区的甲基化水平显著升高（p<0.0001）。
3.2 ZNF382 mRNA表达在DLBCL细胞中显著降低
RT-PCR分析表明，与反应性增生淋巴结组织相比，DLBCL细胞中ZNF382 mRNA的表达水平显著下调（p<0.01）。
3.3 去甲基化药物DAC对DLBCL细胞中ZNF382启动子甲基化水平的影响
MSP检测显示，经DAC干预96小时后，与空白对照组相比，DAC处理组的OCI-LY10细胞中ZNF382启动子甲基化水平显著降低（p<0.01）；在U2932细胞中，2 μmol/L和4 μmol/L DAC处理组也出现甲基化水平显著下降（p<0.05，p<0.01）。
3.4 去甲基化药物DAC对DLBCL细胞中ZNF382 mRNA表达的影响
RT-PCR分析发现，用2 μmol/L DAC处理后，OCI-LY10和U2932细胞中ZNF382 mRNA表达均显著上调（OCI-LY10: p<0.01；U2932: p<0.05）。然而，1 μmol/L和4 μmol/L DAC处理组与空白对照组相比，ZNF382 mRNA表达无显著差异。这可能与高浓度DAC诱导细胞凋亡加剧，从而导致mRNA降解有关。
3.5 去甲基化药物DAC诱导细胞凋亡
流式细胞术检测细胞凋亡率发现，经DAC处理72小时后，随着药物浓度增加，细胞凋亡率呈上升趋势。在OCI-LY10细胞中，各DAC处理组的凋亡率均显著高于空白对照组（p<0.01）。在U2932细胞中，1 μmol/L DAC组凋亡率显著增加（p<0.05），而2 μmol/L和4 μmol/L DAC组凋亡率增加最为显著（p<0.01）。
3.6 过表达ZNF382抑制DLBCL细胞增殖
通过慢病毒包装法构建了稳定过表达ZNF382的DLBCL细胞系。CCK-8实验结果表明，与空载体对照组相比，过表达ZNF382的OCI-LY10细胞在培养24小时和48小时后增殖能力明显降低（p<0.05）；过表达ZNF382的U2932细胞在培养48小时和72小时后增殖能力也显著降低（p<0.05，p<0.01）。
3.7 过表达ZNF382抑制DLBCL细胞迁移
Transwell迁移实验显示，与空载体对照组相比，过表达ZNF382的OCI-LY10细胞迁移数量减少（p<0.01），而过表达ZNF382的U2932细胞迁移数量减少更为显著（p<0.001）。
3.8 过表达ZNF382抑制DLBCL细胞克隆形成能力
软琼脂克隆形成实验表明，与空载体对照组相比，过表达ZNF382显著抑制了OCI-LY10和U2932细胞的克隆形成能力（p<0.01）。
4. 讨论
表观遗传修饰，特别是DNA甲基化，在肿瘤发生发展中扮演着关键角色。本研究证实，在DLBCL细胞中，ZNF382启动子区存在DNA高甲基化，而其mRNA表达显著下调。这提示DNA高甲基化可能通过抑制转录因子结合、招募转录抑制复合物或改变染色质构象等机制，抑制ZNF382的转录和表达，从而可能参与DLBCL的发生发展。ZNF382在DLBCL中可能作为一个重要的抑癌基因发挥作用。
去甲基化药物如DAC和阿扎胞苷（AZA）已用于临床治疗。本研究发现，DAC干预可降低ZNF382启动子甲基化水平，上调其mRNA表达，并诱导DLBCL细胞凋亡。有趣的是，在4 μmol/L的高浓度DAC处理下，ZNF382 mRNA表达的上调趋势并不显著，这可能与高浓度DAC促进细胞凋亡，进而加剧了mRNA的降解有关。这提示2 μmol/L可能是DAC干预的较优浓度。
功能实验进一步证实，过表达ZNF382能显著抑制DLBCL细胞的增殖、迁移和克隆形成能力，这与其潜在的抑癌功能相符。这些发现为理解DLBCL，特别是复发/难治性DLBCL的病理机制提供了新视角，并提示ZNF382可能成为一个有潜力的治疗靶点。未来研究将通过生物信息学筛选ZNF382的下游靶点，并利用小鼠移植瘤模型进行体内验证，以期阐明其在DLBCL发生发展中的关键信号通路。
本研究的一个局限性在于结果未在体内或原代DLBCL细胞系中得到验证。总之，本研究证实ZNF382启动子区DNA高甲基化及其mRNA低表达与DLBCL的进展密切相关，靶向ZNF382或其表观遗传调控可能为DLBCL的诊断和治疗开辟新途径。
