《The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics》：Targeting cholangiocyte S1PR1 signaling alleviates cholestatic liver injury: Mechanistic insight into S1P/p-Stat3 axis
编辑推荐：
靶向胆管细胞S1PR1抑制肝纤维化与炎症的机制研究
袁志航|王杰|张浩然|苗颖颖|柴圆圆|李安琴|唐倩辉|陈清宇|张璐勇|于秦伟|江振洲
新药筛选与药效学评价中心，江苏省药效学研究与评价中心，中国药科大学国家重点实验室，南京210009，中国
摘要
针对胆汁淤积的有效一线治疗方法有限，导致治疗效果不佳，且在无法耐受熊去氧胆酸（UDCA）/奥贝胆酸（OCA）后需要进行肝脏移植。我们研究了胆管细胞鞘氨醇-1-磷酸受体1（S1PR1）在胆汁淤积发病机制中的作用，以寻找新的治疗靶点。我们生成了特异性敲除S1PR1的胆管细胞小鼠（S1pr1ΔIBEC）。胆汁淤积模型包括胆管结扎（BDL）（14天）和0.5%胆酸（CA）饮食（4个月）。在BDL或0.5% CA饮食模型中，胆管细胞中的鞘氨醇-1-磷酸（S1P）及其受体S1PR1的水平显著升高。来自肝星形细胞（HSCs）/内皮细胞的鞘氨醇激酶1（SphK1）衍生的S1P激活了胆管细胞中的S1PR1，促进了Stat3的磷酸化并释放了白细胞介素-6（IL-6）/C-C基序趋化因子（CCL）7，从而重塑了炎症微环境并加剧了肝脏损伤。S1PR1的敲除显著减少了肝脏损伤、纤维化和炎症。同样，使用特异性S1PR1抑制剂W146处理也略微改善了BDL引起的肝脏损伤。通过设计纳米粒子递送的W146，进一步证实了S1PR1在胆管细胞中的功能作用。这表明特异性敲除S1PR1可以缓解由胆道阻塞或慢性胆汁淤积引起的肝脏纤维化和损伤，有助于将S1PR1作为治疗肝脏纤维化和胆汁淤积的靶点。
引言
根据损伤的解剖部位，胆汁淤积病理学上分为两种主要亚型：肝细胞胆汁淤积和胆管细胞胆汁淤积。胆管细胞胆汁淤积包括几种具有临床意义的疾病，如原发性胆汁性肝硬化（PBC）、原发性硬化性胆管炎（PSC）、自身免疫性肝炎重叠综合征、胆石症和胆道闭锁1,2。PBC和PSC是具有不同流行病学特征的胆汁淤积性肝病。2021年的一项研究估计，PBC的全球发病率为每10万人中有0.84–2.75例，PSC的发病率为0.1–4.39例，患病率为1.91–40.2例3。PBC在地理上分布不均，主要影响中年女性（90%–95%）。相比之下，PSC更常见于中年男性，并与炎症性肠病（IBD）密切相关，其共病率在日本为21%，在欧洲为70%4。目前PBC和PSC的治疗选择包括法尼醇X受体（FXR）激动剂5,6（如熊去氧胆酸（UDCA）和奥贝胆酸（OCA）、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）激动剂7,8、成纤维细胞生长因子19类似物9以及免疫调节方法10。
然而，治疗方面尚未取得显著进展，严重病例仍需依赖肝脏移植，而肝脏移植通常预后较差且存在复发风险11。全面研究胆汁淤积性疾病的发病机制可能为发现有效的药物和分子靶点提供新的治疗途径。
鞘氨醇-1-磷酸（S1P）是一种存在于血液中的脂质介质，由神经酰胺在体内通过鞘氨醇激酶（SphK）磷酸化生成12。鞘氨醇激酶分为两种类型：SphK1和SphK213。SphK1主要存在于细胞质和细胞膜中，促进S1P分泌到细胞外空间以发挥其生物学作用。相比之下，SphK2主要位于线粒体、细胞核和内质网中，在维持细胞质和细胞核内的S1P浓度方面起着关键作用。S1P主要作为第二信使，与全身各处的鞘氨醇-1-磷酸受体（S1PRs）结合。迄今为止，已鉴定出五种S1PR亚型，其中S1PR1和S1PR2是肝脏中的主要受体14。通过内皮细胞上的S1PR1内化，肝脏分泌的载脂蛋白M-高密度脂蛋白（HDL）复合物是维持内皮屏障完整性的内源性介质13,15。S1P与HDL结合的内皮细胞S1PR1可促进再生并抑制肝脏纤维化16。在多种急性肝衰竭模型中，发现S1PR1的表达上调<17, 18, 19>。值得注意的是，给予S1PR1功能拮抗剂FTY720或KRP203可减轻肝脏损伤，表明S1PR1具有致病作用<17>。研究还报告了S1PR2拮抗剂JTE-013或S1PR2敲除具有促纤维化作用<20,21。在循环系统中，S1P参与调节血管张力、通透性、损伤后的血管再生和心脏功能<22>。血液（0.5-1 μM）和淋巴液（0.1 μM）中的S1P浓度明显高于组织液（nM水平），这种现象称为S1P浓度梯度<23>。这种梯度有助于T细胞和B细胞以及其他免疫细胞从次级淋巴器官中流出。S1PR1受体的调节剂通过抑制淋巴细胞迁移显示出治疗多发性硬化症的效果<24>。
在PBC和PSC患者的血液中观察到S1P水平升高，同时肝脏内的SphK1表达也增加，表明SphK1活性增强<25>,26。此外，在其他肝脏疾病（包括非酒精性脂肪肝病和肝炎）患者中也记录到S1P浓度升高<13>,27。实验研究表明，敲除SphK1或给予SphK1抑制剂可以在多种小鼠肝病模型中减轻肝脏损伤。具体来说，在胆管结扎（BDL）和四氯化碳（CCl4）模型中，敲除肝库普弗细胞（KCs）中的SphK1会影响CCL2的分泌，而敲除肝星形细胞（HSCs）中的SphK1会影响CCR2的表达<26(p1)。值得注意的是，在使用半乳糖胺和脂多糖（GaN/LPS）的模型中，缺乏SphK1显著减少了TNF-α的分泌<28>。此外，SphK1的敲除可减轻对乙酰氨基酚（APAP）引起的线粒体通透性转变和内质网应激，从而减少肝脏损伤<29>。这些发现表明，在不同类型的肝脏损伤中，SphK1的过度表达可能通过S1P浓度梯度促进免疫细胞的迁移，从而可能介导肝脏损伤（如胆汁淤积）的进展；然而，这些过程的具体机制尚未完全阐明。
此外，已经确定S1PRs在胆管细胞胆汁淤积的发病机制中起重要作用。敲除S1PR2已被证明可以减轻BDL引起的肝脏损伤和纤维化，这可能是由于牛磺胆酸（TCA）通过S1PR2增强了胆管上皮细胞的迁移和增殖<20>。相比之下，S1PR1在胆管细胞胆汁淤积中的作用受到的关注较少。因此，本研究旨在探讨SphK1-S1P-S1PR1信号通路的变化。
实验部分
1. 动物和实验程序
S1pr1loxp/loxp小鼠和K19CreERT小鼠购自杰克逊实验室（美国缅因州巴港）。通过将S1pr1loxp/loxp小鼠与K19-CreERT小鼠杂交，生成了特异性敲除S1PR1的胆管细胞小鼠（S1pr1Δ肝内胆管上皮细胞（IBEC））。用于基因鉴定的引物序列列在表4中。所有实验均使用8-10周大的雄性小鼠。对于BDL实验，在吸入异氟醚和局部麻醉下进行腹部切开术1. S1P-S1PR1信号通路在胆管细胞胆汁淤积中的作用
为了研究S1PR1在各种肝病中的变化，我们利用GEO数据库（GEO159676）中的GEO2R分析了S1pr1基因的表达。PBC、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、PSC或自身免疫性肝炎（AIH）患者的S1pr1（ID: 7903393）表达水平与健康个体相比没有显著差异（图1A）。此外，S1PR1的表达模式在不同类型的肝硬化细胞中有所不同
讨论
胆管细胞是构成体内胆管的上皮细胞。这些细胞可被内源性和外源性刺激激活，参与胆汁的合成和输送到十二指肠。它们通过形成紧密连接和分泌免疫球蛋白A来抵御胆汁中潜在的有害分子和微生物。此外，胆管细胞还通过其基底侧血浆
结论
总之，本研究首次表明，门静脉区域的SphK1水平升高导致S1P浓度增加，进而通过作用于胆管细胞S1PR1诱导Stat3的磷酸化。这一过程促进了炎症介质的分泌，从而在胆管细胞胆汁淤积中建立了炎症微环境。本研究的结果提供了新的治疗靶点和潜力
CRediT作者贡献声明
袁志航：项目管理、方法学、研究、数据分析、概念化。王杰：写作——审稿与编辑、初稿撰写、研究、数据分析、概念化。张浩然：方法学、研究。苗颖颖：方法学、研究。柴圆圆：方法学。李安琴：方法学。唐倩辉：方法学。陈清宇：方法学。张璐勇：写作——审稿与编辑、监督数据可用性声明
原始测序数据已存入基因表达组（GEO）数据库，访问号为GSE159676。支持本研究结果的数据可向通讯作者索取。作者贡献：CRediT
袁志航：概念化、数据管理、研究、方法学、数据分析、项目管理。王杰：概念化、数据管理、数据分析、初稿撰写、审稿与编辑。
致谢
我们衷心感谢中国药科大学动物实验中心的郝正林和赵杰在动物实验方面的支持。
资助
本研究得到了江苏省自然科学基金（BK20221526）、国家自然科学基金（82274200、82074114）以及“双一流”大学项目（CPU2018GY33）的支持。
