调节由硫引起的腔肠胺荧光红移：将实验与理论联系起来

《Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry》：Tuning sulfur-induced red shift of coelenteramide fluorescence: linking experiment and theory

硫代coelenteramide衍生物的合成及其光物理性质研究表明，硫孤对电子通过调控电子结构间接稳定激发态，导致发射红移，为新型发光中间体设计提供理论依据。

　　

Germano Giuliani|Minyong Li|Xingye Yang|Marco Paolino|Federica Castriconi|Andrea Cappelli|Lluís Blancafort

意大利锡耶纳大学生物技术、化学与药学系，A. Moro路2号，53100锡耶纳

摘要

为了研究化学修饰对其光物理行为的影响，我们合成了含有硫取代基的刺胞酰胺衍生物并对其进行了表征。在甲醇中记录的荧光光谱显示，与参考化合物h-刺胞酰胺3相比，存在一致的光谱红移现象。我们采用了时间依赖密度泛函理论（TD-DFT）结合自然键轨道（NBO）和自然跃迁轨道（NTO）分析方法，来模拟化合物3和4a-f的电子结构及激发性质。计算结果很好地再现了实验观察到的光谱变化，并强调了硫孤对在调节电子结构以及间接稳定激发态方面的关键作用，而非直接增强分子内的电荷转移（ICT）过程。理论分析表明，硫孤对与π*和σ*轨道均发生相互作用：前者促进电子离域，后者通过超共轭作用参与调节，从而影响基态电子结构并有助于激发态的稳定。NTO分析进一步证实，硫并未直接参与S0→S1的跃迁，但间接影响发射性质。通过比较化合物3与含硫取代衍生物，我们探讨了微小的电子修饰如何影响荧光现象，这对新型化学发光和生物发光中间体的设计具有指导意义。

引言

生物发光蛋白是一种能够通过生化反应发出光的特殊分子[1]。这类蛋白存在于萤火虫、水母、真菌及多种海洋细菌等生物体内，因其独特的分子行为和多功能性而长期吸引着科学家的研究[2]。这一现象已被广泛应用于分子生物学、生物医学成像和环境监测等多个领域[3]。在医学研究中，生物发光蛋白被用作检测疾病机制[4]、筛选潜在药物候选物[5]以及监测治疗反应[6]的示踪工具。其中，生物发光成像（BLI）是一种非侵入性技术，能够实时追踪活体动物模型中的疾病进展和治疗效果[7]。 鉴于生物发光系统的广泛应用，科学家们投入了大量精力优化相关酶及其底物。通过定向突变技术，可以改造酶的活性位点，提高底物适应性、催化效率并改变发射光谱[8]。这些改造对于使酶适应新的合成底物或稳定关键反应中间体尤为重要[9]。 同时，对底物的化学修饰也被证明能有效调节生物发光反应的光谱和量子效率[10]。例如，延长π-共轭结构、引入电子供体基团或增强分子骨架的刚性都能导致发射波长红移，从而提高光子输出。这种红移特性在体内成像中尤为有利，因为较长波长的光能更有效地穿透生物组织并减少散射[11]。然而，要实现这些改进，需深入理解其发光机制。 通常，生物发光过程涉及荧光素酶（如Renilla荧光素酶）催化小分子底物（如天然刺胞嗪1或其简化衍生物h-刺胞嗪2）的氧化。在分子氧存在下，反应生成高能过氧化物中间体，该中间体迅速转变为1,2-二氧杂环酮衍生物[13]，随后分解释放CO2并形成电子激发态的刺胞酰胺（以h-刺胞酰胺3为例），最终通过发射光子恢复到基态[14]。因此，研究刺胞酰胺的光物理行为对于理解自然发光过程至关重要。尽管刺胞酰胺在化学发光和生物发光过程中起着核心作用，但目前仍缺乏对其内在光物理性质如何响应结构变化的详细认识。虽然刺胞酰胺常被用作参考系统来解释发光现象，但局部结构变化与激发态和发射态能量变化之间的具体关系仍不明确。这些未知因素限制了基于刺胞酰胺的发光体的精准调控。 在本研究中，我们以h-刺胞酰胺3的荧光特性为研究对象，结合实验光谱学与TD-DFT、NBO和NTO分析方法，探讨了硫取代对其电子结构和发射性质的影响。 我们的团队合成了一系列h-刺胞嗪硫衍生物，这些衍生物的发光强度和发射波长均比原始化合物2有所增强[12, 15]。尽管仅进行了简单的巯基引入修饰，但这些结构变化仍导致发射能量降低。这种光谱红移现象在化学发光和生物发光过程中均得到验证，表明其源于分子电子结构的内在改变。有趣的是，类似的共轭效应也出现在含硫、氧或硒的刺胞嗪衍生物中[16, 17]。我们的长期目标是结合实验和理论方法设计新的刺胞嗪衍生物。作为第一步，我们重点研究了h-刺胞酰胺3的荧光特性，因为它被认为是2发光过程中的最简单中间体[18]。研究刺胞酰胺衍生物的荧光特性有助于深入了解化学发光机制，因为这些衍生物的激发态性质与发光过程密切相关[19]。为此，我们采用合成方法制备了一系列含硫的刺胞酰胺衍生物4a-f（见图1），便于进行光谱和计算分析，从而评估特定结构变化对其激发和发射性质的影响。一旦模型通过实验数据验证，便可进一步扩展到化学发光和生物发光过程中涉及的其他两种发光物种（酰胺和酚酸根阴离子形式）[18]。

合成方法

刺胞酰胺衍生物的合成遵循支持信息中的方案S1和S2所示步骤进行。详细的合成方法和产物表征也见补充信息（SI）。这里报告了h-刺胞酰胺3合成的最后一步：将硅保护中间体5在四氢呋喃（THF）中用四丁基氟化铵（TBFA）脱硅处理，得到目标酰胺（产率74%）。

光学测量

相关化合物的光学性质测量结果见补充信息。

结论

本研究合成了多种含硫取代的刺胞酰胺衍生物（4a-f），探讨了结构修饰对其荧光性质的影响。通过以3及其硫取代衍生物4a作为最小化且性质明确的参考体系，我们利用实验和计算方法揭示了精细的结构-性质关系。所有含硫化合物在甲醇中的荧光测量均显示出了光谱红移现象。

作者贡献声明

Germano Giuliani：撰写初稿、方法设计、实验研究、数据分析、概念构建。 Minyong Li：审稿与编辑、结果验证、研究监督、方法设计。 Xingye Yang：撰写初稿、数据分析。 Marco Paolino：审稿与编辑、数据分析。 Federica Castriconi：方法设计、数据分析。 Andrea Cappelli：审稿与编辑、撰写初稿、方法设计。

作者声明

所有作者对本研究均做出了同等贡献。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究部分由西班牙科学与创新部（项目编号PID2022-138062NB-I00，针对L. B.）资助。